金絲桃苷調控miR-375/CXCL1軸影響腦缺血再灌注損傷研究*

夏麗秀，肖 瑞，鄭 莉

(湖北省中西醫結合醫院老年病科，武漢 430000)

腦缺血患者在臨床上具有較高的致死率，腦缺血對中老年患者的健康造成嚴重威脅。再灌注治療是一種能有效緩解腦缺血的技術，但是突然對腦組織血流量進行改善容易導致患者出現再灌注損傷，即缺血再灌注損傷(I/R)[1-2]。氧化應激誘導的細胞凋亡、細胞壞死等病理過程均參與I/R發展[3]。開展I/R分子機制研究對于開發更多有效藥物、識別新的生物靶點具有重要意義。

金絲桃苷(Hyp)又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，屬于黃酮醇苷化合物(化學結構式見圖1)，具有抗炎、利尿、降血糖、保護心腦血管等作用[4]。研究顯示，Hyp能上調miR-138的表達，保護缺氧誘導的心肌細胞損傷[5]。有研究發現，Hyp通過一氧化氮信號通路減輕缺氧葡萄糖再灌注誘導的皮質神經元損傷[6]。然而，Hyp對神經細胞氧葡萄糖剝奪/復氧(OGD/R)損傷的作用機制仍有待進一步明確。

圖1 Hyp化學結構式

有研究表明，miR-375上調可通過抑制SP1，減輕多巴胺能神經元的損傷[7]。上調miR-375被證實參與了毛蕊異黃酮對大鼠腦I/R的保護作用[8]。C-X-C趨化因子配體1(CXCL1)是趨化因子的亞類，具有募集并激活白細胞的功能，參與多種疾病發展[9]。皮質神經元來源的外泌體miR-181c-3p通過下調缺血性腦損傷大鼠星形膠質細胞CXCL1來抑制神經炎癥[10]。miR-429通過抑制CXCL1對腦微血管內皮細胞OGD/R誘導損傷發揮保護作用[11]。本研究旨在探討Hyp在I/R中的作用，并結合生物信息學分析和細胞實驗探究其在I/R治療中的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Hyp(C21H20O12，相對分子質量464.37，純度>98%，中國藥品生物制品檢定所)，小鼠腦神經瘤(N2a)細胞(中國科學院上海細胞生物研究所)，標準胎牛血清、細胞培養專用青鏈霉素混合液、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、電化學發光(ECL)超敏發光液(北京索萊寶科技有限公司)，無糖DMEM、D-葡萄糖溶液(武漢普諾賽生命科技有限公司)，CCK-8試劑盒、雙熒光素酶基因檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，全波長多功能酶標儀[美谷分子儀器(上海)有限公司]，流式細胞儀(美國BD公司)，Trizol試劑、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(上海碧云天生物技術有限公司)，實時聚合酶鏈式反應(PCR)擴增儀StepOnePlus(美國Abi公司)，第一鏈cDNA合成試劑盒、2×SYBR Green PCR SuperMix(美國Apexbio公司)，引物由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成，抗-CXCL1、抗-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、抗-免疫球蛋白G(英國Abcam公司)，Lipofectamine 3000(美國Thermo Fisher公司)。過表達、敲減質粒與miRNA模擬體與抑制劑(上海吉瑪制藥技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析

從基因表達綜合數據庫GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中獲得I/R相關芯片表達數據(GSE78731)，且對I/R中差異表達的基因進行分析。使用DAVID 3.0在線網站(https://david.ncifcrf.gov/)對基因進行GO富集分析。DisGENET 6.0網站(http://disgenet.org/search)用于檢索I/R風險基因。STRING 11.0網站(http://string-db.org/)用于蛋白互作用分析。DIANA TOOLS在線網站(http://snf-515788.vm.okeanos.grnet.gr)用于對miRNA進行Pathway富集分析。StarBase在線網站(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)、TargetScan在線網站(http://www.targetscan.org/vert_71/)用于檢索基因的上游靶標。

1.2.2臨床樣本

收集2019年8月至2020年6月在本院治療的35例I/R患者血漿，用于miR-375/CXCL1表達檢測。另外收集35例年齡與性別均匹配的健康志愿者血漿作為對照(Control)。所有血液樣品均在液氮中保存備用。所有參與者均對本研究知曉并簽署書面知情同意書。

1.2.3體外I/R模型建立

采用神經母細胞瘤細胞N2a建立I/R細胞模型。OGD/R處理：細胞在缺氧(5%CO2、95%N2)的無糖培養基中孵育4 h；用含有4.5 g/L葡萄糖和10%胎牛血清的DMEM培養基替換無糖培養基，在常氧條件下再孵育24 h。對OGD/R處理后的N2a細胞分別添加10、30、100 μmol/L的Hyp進行處理以確定最佳使用濃度，Control細胞添加等量的二甲基亞砜(DMSO)。

1.2.4細胞轉染

構建CXCL1敲減(si-CXCL1)及過表達(OE-CXCL1)質粒，分別以si-NC與NC作為對照，將以上質粒與miR-375抑制劑(inh-miR-375)及陰性對照(inh-NC)轉染至N2a細胞，轉染過程按照Lipofectamine 3000轉染試劑盒說明書進行。

1.2.5CCK-8檢測細胞活力

N2a細胞接種于96孔培養板，每孔5×103個細胞。分別在培養的0、24、48、72 h向每個培養孔中加入10 μL的CCK-8試劑，再孵育2 h后使用多功能酶標儀檢測各孔吸光度值，檢測波長為450 nm。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡

收集N2a細胞，Binding Buffer重懸，每管中加入1×105個細胞，分別使用5 μL Annexin V-FITC與5 μL 碘化丙啶(PI)進行避光染色，15 min后通過流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡率。

1.2.7實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測CXCL1的mRNA表達

采用Trizol試劑提取血漿或N2a細胞的總RNA。逆轉錄試劑盒合成cDNA。在實時PCR擴增儀StepOnePlus上使用2×SYBR Green PCR SuperMix試劑盒進行qRT-PCR分析。使用2-ΔΔCT法計算mRNA相對表達量，U6作為miR-375的內參，GAPDH作為CXCL1的內參。

1.2.8Western blotting檢測CXCL1的蛋白表達

采用RIPA裂解液裂解細胞，BCA試劑盒測定蛋白濃度，行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將蛋白轉移至PVDF膜上。室溫下使用5%脫脂牛乳封閉1 h。4 ℃下將膜與一抗CXCL1(1∶100)、GAPDH(1∶1 000)過夜孵育。之后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗免疫球蛋白G(1∶2 000)孵育1 h。ECL顯影并借助I-mage J軟件計算蛋白相對灰度值。

1.2.9雙熒光素酶報告實驗驗證miR-375和CXCL1的靶向關系

合成CXCL1野生型(WT)與突變型(MUT)的3′UTR端片段并克隆到熒光素酶報告載體，使用Lipofectamine 3000將CXCL1-WT、CXCL1-MUT分別與miR-375 mimic或miR-375 NC共轉染至N2a細胞，在37 ℃、含5%CO2的環境中培養48 h。使用雙熒光素酶檢測試劑盒評估各組細胞的熒光素酶活性。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 Hyp對ODG/R處理的N2a細胞增殖和凋亡的影響

與Control細胞比較，OGD/R細胞增殖活力被抑制，凋亡增加，而加入Hyp后，細胞增殖活力有所改善、凋亡減少，且隨Hyp濃度的增加呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖2。因100 μmol/L濃度的Hyp對N2a細胞的影響最顯著，因此將該濃度處理的細胞用于后續實驗。

A：不同細胞增殖活力；B：不同細胞凋亡率；**：P<0.01，與Control比較；#：P<0.05，與ODG/R比較；##：P<0.01，與OGD/R比較。

2.2 生物學分析結果

GSE78731數據集中大腦中動脈閉塞(MCAO)模型大鼠中差異表達的基因，見圖3。對MCAO組中表達上調的基因進行GO功能富集分析，結果顯示，基因被富集在一條炎性通路(GO:0006954～inflammatory response)中。將該通路中富集的基因CCL7、CD8A、SPP1、CCL2、CXCL1、SERPINA3N與I/R發病風險基因進行蛋白互作用分析，發現CXCL1其他基因具有較強關聯。

圖3 GSE78731數據集MCAO差異表達基因

2.3 Hyp對OGD/R模型中CXCL1表達水平的影響

與Control比較，I/R患者血漿中CXCL1的表達顯著增強(P<0.05)，見圖4A。與Control比較，OGD/R CXCL1的mRNA和蛋白表達增強，但其表達增強能被Hyp抑制(P<0.05)，見圖4B～D。

A：不同患者血漿中CXCL1相對表達量；B：不同細胞CXCL1的mRNA相對表達量；C：不同細胞CXCL1的蛋白表達情況；D：Western blotting實驗統計結果。**：P<0.01，與Control比較；#：P<0.05，與OGD/R比較；##：P<0.01，與OGD/R比較。

2.4 Hyp對N2a細胞存活的促進作用

與Control比較，OGD/R細胞增殖活力明顯降低、凋亡增加，而OGD/R+Hyp細胞活力較OGD/R明顯升高、凋亡減少(P<0.05)。與OGD/R+Hyp+NC比較，OGD/R+Hyp+OE-CXCL1細胞增殖活力降低、凋亡增加(P<0.05)，見圖5。

A：不同細胞增殖活力；B：不同細胞流式細胞術檢測結果；C：不同細胞凋亡率統計。**：P<0.01，與Control比較；##：P<0.01，與OGD/R比較；^：P<0.05，與OGD/R+Hyp+NC比較；^^：P<0.01，與OGD/R+Hyp+NC比較。

2.5 miR-375下游靶標情況

使用StarBase、TargetScan在線預測網站搜索CXCL1的上游靶miRNA并取交集(圖6A)。miR-375與CXCL1的特異性結合位點見圖6B。DIANA TOOLS對交集miRNA進行pathway注釋分析，發現miR-375富集在Hippo信號通路(hsa04390)、p53信號通路(hsa04115)兩個通路中，Hippo與p53信號通路以往均被證實與I/R密切相關[12-13](圖6C)。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，miR-375 mimic能顯著降低CXCL1-WT的熒光素酶活性(P<0.05)，見圖6D。qRT-PCR結果顯示，miR-375在I/R患者血漿與OGD/R模型中均表達降低(P<0.05)見圖6E、F。與miR-NC比較，miR-375 mimic CXCL1的mRNA和蛋白表達被抑制(P<0.05)，見圖6G。

A：StarBase、TargetScan網站預測結果；B：miR-375與CXCL1的特異性結合位點；C：miRNA的通路分析結果；D：雙熒光素酶報告檢測結果；E：qRT-PCR檢測miR-375在I/R患者血漿中的表達；F：qRT-PCR檢測miR-375在OGD/R模型中的表達；G：CXCL1的mRNA相對表達量；H：CXCL1的蛋白表達情況；I:Western blotting實驗統計結果。**：P<0.01，與miR-NC和CXCL1-WT共轉染比較；##：P<0.01，與Control比較；^^：P<0.01，與miR-NC比較。

2.6 Hyp在miR-375/CXCL1軸的作用

與Control比較，OGD/R細胞增殖活力被抑制，凋亡增加，加入Hyp后細胞增殖活力提高，凋亡減少(P<0.05)。與OGD/R+Hyp+inh-NC比較，OGD/R+Hyp+inh-miR-375細胞增殖活力減少，凋亡增加(P<0.05)。與OGD/R+Hyp+inh-miR-375+si-NC比較，OGD/R+Hyp+inh-miR-375+si-CXCL1細胞增殖活力提高，凋亡減少(P<0.05)。見圖7。

A：不同細胞增殖活力；B～H：不同細胞流式細胞術檢測結果；I：不同細胞凋亡率統計。**：P<0.01，與Control比較；##：P<0.01，與OGD/R比較；^^：P<0.01，與OGD/R+Hyp+inh-NC比較；&：P<0.05，與OGD/R+Hyp+inh-miR-375+si-NC比較；&&：P<0.01，與OGD/R+Hyp+inh-miR-375+si-NC比較。

3 討 論

Hyp廣泛存在于各種植物中，如金絲桃科、桔梗科、杜鵑花科、藤黃科等[14]。已有研究證明，Hyp可顯著減輕I/R誘導的急性腎損傷、腎小管細胞凋亡和氧化應激[15]。此外也有研究證實，Hyp通過激活多巴胺能神經元Nrf2/HO-1信號，抑制6-羥基多巴胺誘導的氧化應激[16]。本研究通過構建腦I/R體外細胞模型，證實了Hyp能夠減少OGD/R處理的N2a細胞凋亡，促進細胞增殖活力。這與之前Hyp改善腦缺血損傷的研究結果一致[17]。

進一步對Hyp在腦I/R中發揮作用的潛在機制進行探究。本研究借助GEO數據庫中I/R相關芯片，篩選了在I/R中差異表達的基因并將CXCL1納入研究。VICTORIA等[18]在研究中發現，CXCL1在I/R模型小鼠中表達增強。本研究進一步通過臨床檢測和細胞實驗證實了CXCL1在腦I/R患者與OGD/R細胞模型中的表達升高。此外，實驗發現OGD/R誘導的細胞內高表達CXCL1被Hyp抑制。繼續干預CXCL1的表達并設計功能實驗，結果顯示，與Control比較，OGD/R細胞活力被抑制，凋亡增加，而Hyp在改善細胞凋亡、促進細胞活力方面效果明顯。但轉染CXCL1后Hyp對OGD/R細胞的保護作用被抑制，提示Hyp對腦I/R的改善作用可能是通過抑制CXCL1的表達來實現。本研究證實了miR-375與CXCL1存在靶向結合關系，qRT-PCR實驗證實了miR-375在腦I/R患者與OGD/R模型中表達下調，miR-375可能在腦I/R發展中發揮重要作用。以往研究顯示，敲除MALAT1可通過調節miR-375/PDE4D軸減輕大鼠腦I/R損傷[19]。另外，miR-375能夠通過靶向Ctgf減輕腦I/R損傷[20]。WANG等[21]發現，上調miR-375表達能夠促進毛蕊異黃酮對腦缺血再灌注大鼠的保護作用。本研究發現，與OGD/R組比較，加入Hyp能夠抑制N2a細胞凋亡，但是Hyp的作用被inh-miR-375部分抵消。敲減CXCL1也能部分逆轉inh-miR-375對Hyp的作用，提示Hyp對I/R細胞模型的影響可能是通過調控miR-375/CXCL1實現的。

本研究也存在一定不足之處。例如，僅從臨床檢測及體外I/R細胞實驗的角度對I/R中miR-375/CXCL1的差異表達進行了驗證，未進一步從體內動物實驗的角度對miR-375/CXCL1作用網絡的影響及Hyp在I/R中的作用進行探究。此外，未進一步探究Hyp可能調控的信號通路，這也是作者之后要重點關注的方向。

綜上所述，本研究證實Hyp通過調控miR-375/CXCL1軸影響OGD/R處理的N2a細胞增殖和凋亡，進一步明確了Hyp在I/R中發揮保護作用的分子機制，為I/R的治療提供了潛在的新靶點。