SOX4基因表達特征的泛癌分析*

李子木，閆 虹，董囡囡，康媛媛

(1.中國人民解放軍北部戰區總醫院口腔內科,沈陽 110013；2.中國醫科大學口腔醫學院急診黏膜科，沈陽 110001)

SRY-related HMG-box(SOX)作為一類常見的轉錄因子家族，參與調控胚胎的發育和分化、神經系統的形成和血管發育等過程[1-2]。SOX4是SOX家族C亞族的重要成員之一，定位于人類Y染色體6p22.3,編碼蛋白質的相對分子質量為47×103[3-4]。研究表明，SOX4在多種腫瘤中存在異常表達，并與腫瘤患者的預后密切關聯[5-6]。VERVOORT等[7]研究報道，SOX4在肺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、直腸癌、肝癌及胰腸癌中均高表達。沉默SOX4基因可以抑制黑色素瘤和其他腫瘤細胞的增殖和轉移能力[8-9]。在乳腺癌中，SOX4能夠促進上皮間充質化的過程[2]；但在膠質瘤細胞系中，SOX4通過激活p53-p21信號通路和下調磷酸化Akt1，發揮抑癌作用[10]。異常表達的SOX4在不同類型的惡性腫瘤中會對腫瘤生物學行為產生不同的影響。盡管基于細胞試驗或動物研究的證據支持SOX4與腫瘤之間的聯系，但目前罕見關于SOX4泛癌研究的報道。因此，本研究通過分析癌癥基因組圖譜(TCGA)和基因表達綜合數據庫(GEO)，揭示SOX4基因在各種腫瘤中的表達情況，與疾病的預后作相關性分析，并在3種常見腫瘤細胞中進行驗證，進一步闡明SOX4基因的突變情況及與免疫浸潤的關系。本研究有助于深入了解SOX4異常表達的病因及其調控機制，為SOX4的靶向治療提供依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

TCGA(http://can-cergenome.nil.gov)數據庫收集了腫瘤患者臨床的基本信息，包括基本資料、臨床分期、病理分期和生存情況等。下載腫瘤mRNA-seq數據及臨床相關數據。乳腺癌細胞(MCF-7)、乳腺上皮細胞(MCF-10A)、口腔鱗狀細胞癌細胞(SCC-4)、人類永生化表皮細胞(HaCat)、人非小細胞肺癌細胞(A549)、人正常肺上皮細胞(BEAS-2B)均購于中國科學院上海細胞庫。DMEM培養基和胎牛血清購于美國Gibco公司，1640培養基購于美國Corning公司。Trizol購于美國Gibco公司,逆轉錄試劑盒和定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒均購于日本TaKaRa公司,引物由上海吉瑪生物有限公司設計并合成，BCA試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司,SOX4單克隆抗體、單克隆抗體均購于英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1基因表達

利用TIMER2(http://timer.cistrome.org)工具，采用Exploration部分的Gene_DE模塊，挖掘TCGA數據庫中SOX4在腫瘤組織中的表達情況。利用GEPIA2中“Expression DIY”部分的“Stage Plot”模塊進一步探索SOX4的表達與腫瘤臨床病理分期之間的相關性，SOX4的表達水平采用Log2(TPM+1)量表表示；利用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)網站中“CPTAC analysis”模塊，挖掘TCGA數據庫中SOX4蛋白表達的水平。

1.2.2細胞培養

MCF-7、MCF-10A、SCC-4、HaCat接種于6孔板，在含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM混合培養基中，置于5%CO2、37 ℃的加濕細胞培養箱中常規培養。A549、BEAS-2B接種于6孔板中，在含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的1640混合培養基中，置于5%CO2、37 ℃的加濕細胞培養箱中常規培養。培養基每3天換液1次。

1.2.3定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)

收集6種細胞，利用Trizol試劑提取細胞RNA，通過逆轉錄，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為對照，進行qPCR擴增。逆轉錄體系如下：5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)4 μL，RNA 1 μg,RNase Free dH2O添加至20 μL。逆轉錄條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，4 ℃進行保存。PCR體系如下：SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus，2×)10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX染料 0.2 μL，cDNA溶液 2 μL，RNase Free dH2O添加至20 μL。SOX4：上游引物CACTCCTCCTCTTCCTCCTC，下游引物GCCGACGAC GAACTGAAG。GAPDH：上游引物GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，下游引物GAAGATGGTGATGGGATTTC。PCR條件如下：95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，共40個循環，60 ℃，1 min；95 ℃，0.15 s。以2-ΔΔCT表示相對定量結果，應用Graphpad prism 5軟件對RT-qPCR結果進行分析。

1.2.4蛋白質印跡法(Western blotting)

收集6種細胞，利用BCA試劑盒提取細胞蛋白。經10%十二烷基硫酸鈉(SDS)、5%聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳后進行轉膜。5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入鼠抗人SOX4單克隆抗體4 ℃過夜。加入二抗兔抗鼠免疫球蛋白G(IgG)37 ℃下孵育1 h，堿性磷酸酶顯色，增強化學發光(ECL)，掃描并拍照。采用凝膠成像分析軟件對結果進行半定量分析。

1.2.5生存分析

利用GEPIA2網站“Survival Analysis”模塊獲取TCGA數據庫中不同SOX4對腫瘤患者總生存期(OS)和無病生存期(DFS)的影響，結果以單基因生存分析圖表示(Kaplan-Meier曲線)。設定“臨界值-高(50%)”“臨界值-低(50%)”作為拆分高表達組和低表達組的表達閾值，探索SOX4與腫瘤患者生存因素之間的表達模式。

1.2.6基因突變分析

通過cBioPortal網站(https://www.cbioportal.org)“Query”部分選擇TCGA泛癌圖譜分析，挖掘SOX4在TCGA數據庫中的變異情況，包括突變頻率、突變類型和拷貝數變化。點擊“Mutation”模塊，顯示SOX4基因突變位點信息。

1.2.7免疫浸潤分析

利用TIMER2工具“Immune”模塊挖掘TCGA數據庫腫瘤中SOX4的表達與免疫浸潤之間的相關性。選擇Treg、單核細胞、內皮細胞、腫瘤相關成纖維細胞(CAF)為研究對象，應用QUANTISEQ、CIBERSORT、MCPCOUNTER、XCELL等不同算法進行免疫浸潤評估。

1.2.8富集分析

一種價值觀要真正發揮作用，必須融入社會生活，與社會生活緊密聯系起來，讓人們在實踐中感知它、領悟它，增強認同感和歸屬感。志愿服務活動，是人人可為、人人能為的重要載體，有利于增強社會主義核心價值觀的吸引力、感染力，提高人們對主流價值觀的認同感。

利用STRING(https://string-db.org)數據庫篩選出50個有實驗驗證、與SOX4相結合的蛋白。本研究中輸入“SOX4”，物種選擇“人類”，證據類型選擇“experiments”，置信度選擇“low confidence(0.150)”，最大數相互作用選擇“50”。利用GEPIA2數據庫“Expression Analysis”部分的“Similar Genes Detection”模塊篩選前100個與SOX4相關靶向基因，利用Jvenn(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)網站對50個SOX4結合蛋白、前100個與SOX4相關靶向基因進行交叉分析。此外，DAVID網站(https://david.ncifcrf.gov)和“ggplot2”(https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/index.html)R軟件包用于KEGG通路分析。

1.3 統計學處理

采用R4.0.3統計軟件進行分析。采用Wilcoxon秩和檢驗進行兩組間比較，兩組以上比較使用Kruskal-Wallis秩和檢驗。采用Kaplan-Meier法進行生存分析。采用Pearson相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基因和蛋白表達情況

與正常組織比較，SOX4在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸潤癌(BRCA)、膽管癌(CHOL)、結腸癌(COAD)、食管癌(ESCA)、多形性膠質細胞瘤(GBM)、頭頸鱗狀細胞癌(HNSC)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、肝細胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤(PCPG)、前列腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、胃癌(STAD)、甲狀腺癌(THCA)和子宮內膜癌(UCEC)中的表達明顯升高，而在腎透明細胞癌(KIRC)、腎嫌色細胞癌(KICH)組織中的表達明顯降低，見圖1。CPTAC數據庫分析結果顯示，SOX4蛋白在乳腺癌、UCEC和LUAD中的表達水平明顯升高，見圖2。利用GEPIA2數據庫，分析不同腫瘤組織中SOX4蛋白表達水平與腫瘤患者臨床病理分期之間的相關性，發現SOX4蛋白表達與ESCA、LIHC、胰腺癌(PAAD)、皮膚黑色素瘤(SKCM)和THCA的病理分期密切相關，見圖3。RT-qPCR和Western blotting結果見圖4，3種腫瘤細胞中SOX4 mRNA和SOX4蛋白表達水平均上調(P<0.05)，這與網站中獲得的結論一致。

**:P<0.01；***:P<0.001,與正常組織比較。

***:P<0.001,與正常組織比較。

圖3 SOX4的表達與不同腫瘤臨床分期之間的關系

A：RT-qPCR結果；B：Western blotting結果；**：P<0.01。

2.2 生存分析

SOX4高表達與LIHC患者OS預后不良明顯相關(P=0.007 3),而SOX4低表達與KIRC、腦低級別膠質瘤(LGG)、胸腺癌(THYM)患者OS預后不良明顯相關(P<0.05)，見圖5A。DFS數據分析結果顯示，SOX4高表達與ESCA、PAAD患者不良預后相關(P<0.05),而SOX4低表達與UCEC患者不良預后相關(P<0.05)，見圖5B。

A：不同腫瘤的OS；B：不同腫瘤的DFS。

2.3 基因突變分析

以SOX4擴增為主要變異類型的BLCA患者SOX4基因突變頻率最高(>15%)。在所有的卵巢漿液性囊腺癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBC)、葡萄膜黑色素瘤、CHOL和LIHC患者中，絕大多數均為SOX4拷貝數擴增，見圖6。圖7進一步顯示，SOX4遺傳變異的類型、位點和病例數。SOX4錯義突變是主要的遺傳變異類型，在1例SKCM和1例COAD患者中檢測到E111K/Q的改變。

圖6 SOX4在腫瘤中的變異類型

圖7 SOX4變異突變位點的變化頻率

2.4 免疫浸潤分析

研究TCGA數據庫中腫瘤免疫細胞的浸潤水平與SOX4基因表達之間的關聯，發現在HNSC、HNSC-HPV-和THCA中，Treg細胞的免疫浸潤與SOX4表達之間呈正相關。SOX4的表達與SARC中單核細胞的浸潤呈負相關。在CESC、COAD、HNSC、HNSC-HPV-、KIRC、LUSC和SKCM中，SOX4與內皮細胞的浸潤呈正相關。同樣，在CESC、COAD、ESCA、HNSC、HNSC-HPV-、KIRC、LUSC、READ和STAD中，SOX4表達與CAF之間呈正相關，但與TGCA中CAF的浸潤呈負相關。見圖8。

圖8 SOX4表達與免疫細胞浸潤的相關性

2.5 富集分析

圖9 交叉分析結果

圖10 SOX4相關基因KEGG通路分析

3 討 論

SOX家族是一個龐大且功能廣泛的轉錄因子家族，包含至少20個成員，該家族成員的產物都具有一個HMG基序保守區[11-12]。SOX4是SOX家族的重要成員之一，現有研究證明SOX4基因可調節細胞信號通路，影響細胞增殖、分化和凋亡等過程，并通過轉錄調節促進或抑制腫瘤的生長[13]。通過文獻檢索，作者發現罕有研究從整體腫瘤角度對SOX4進行泛癌分析。因此，本研究基于公共數據庫，從基因表達、變異和功能機制等方面對不同腫瘤中的SOX4進行了全面挖掘和分析。

本研究首先探討了TCGA數據庫中SOX4基因的表達情況和對患者預后的影響。在LGG和THYM患者中，SOX4呈高表達，但生存分析結果顯示，SOX4高表達的患者預后良好。分析兩者結果不一致的原因可能有：(1)SOX4高表達或低表達組的患者數量較少，可能需要更大的樣本量來驗證上述結論；(2)需要更深入的分子實驗證據來確定SOX4的高表達在上述腫瘤的發生中起重要作用，否則其可能僅僅是正常組織中抵抗腫瘤變化的結果。此外，為進一步驗證SOX4在腫瘤中的致病作用，作者收集了SCC-4、MCF-7及A549，與對照細胞進行比較。在體外分別從mRNA和蛋白水平檢測了SOX4的變化，發現mRNA和蛋白表達水平均明顯升高，這與數據庫的結果相一致。

由于SOX4在多種腫瘤中的表達存在明顯異常，本研究深入探討了其變異特征，發現擴增是最常見的變異類型。通過軟件篩選前50個有實驗驗證的相關蛋白，發現Mex3A、HDAC2、ZNF669、ILF2、KHDRBS1和ZNF260與SOX4相關。盡管上述蛋白在腫瘤致病中的不同作用已被報道，但其對腫瘤的確切致病機制尚不清楚，這也是未來研究的重點。

腫瘤浸潤性免疫細胞是復雜腫瘤微環境的重要組成部分。依據細胞類型，其可能調節腫瘤的致病過程[14]。Treg是維持機體免疫耐受的重要因素之一。早期的研究顯示，在各種共刺激和共抑制受體的作用下，Treg在免疫穩態、自身免疫和抗腫瘤免疫中發揮重要作用[15]。不同的單核細胞在分泌抑瘤介質、促進血管生成、重塑細胞外基質、募集淋巴細胞及分化為腫瘤相關巨噬細胞和樹突狀細胞等方面實現了促瘤和抗瘤免疫功能[16]。CAF可通過多種機制促進腫瘤進展，包括可溶性因子和細胞外基質的分泌，血管生成、免疫和代謝的調節[17]。本研究發現，在某些特定腫瘤中，SOX4表達與Treg、單核細胞、內皮細胞和CAF之間存在緊密關聯。此外，作者對所有的SOX4靶向結合蛋白和SOX4蛋白表達相關基因進行了富集分析，發現SOX4與“病毒致癌”密切相關。SOX4可通過一系列正反饋機制促進病毒的復制，從而影響腫瘤的進程[18]。研究表明，SOX4與“腫瘤MicroRNA”也存在相關性，例如miRNA-214-5p通過靶向SOX4抑制PRAD細胞的增殖[19]，miRNA-212通過靶向SOX4在大腸癌中發揮抑癌作用[20]，miRNA-34a-5p通過靶向SOX4調節Wnt/β-連環蛋白信號通路進而調節神經母細胞瘤的進展[21]。

綜上所述，SOX4的泛癌分析表明，多個腫瘤中的SOX4存在表達異常，SOX4與患者的臨床預后、基因突變、免疫細胞浸潤等均有相關性。本研究結果為了解SOX4的功能提供了初步依據，但其具體的生物學作用和機制還需要進一步的實驗驗證。