多功能木聚糖水解酶的研究及其在食品領域的潛在應用

韓 雪，王鈺璐，于海燕，辛鳳姣

（中國農業科學院 農產品加工研究所，北京 100193）

木質纖維素是一種重要的可再生生物質資源，因其清潔性及儲量豐富的特點已成為潛在的規模化生產生物燃料及高附加值生物基產品的原料[1]。但是，天然木質纖維素的化學成分及結構都十分復雜，需利用多種糖類水解酶共同作用，才能對其進行有效的生物降解[2]。木質纖維素生物質由3 種主要成分組成，即纖維素（質量分數40%～60%）、半纖維素（質量分數20%～40%）和木質素（質量分數10%～25%）等[3]。半纖維素是一組非纖維素異質多糖的總稱，由戊糖（木糖和阿拉伯糖）、己糖（甘露糖、葡萄糖和半乳糖）和糖酸（甲基葡糖醛酸）等組成[4]。根據其主鏈中存在的主要單糖進行分類，包括木聚糖、木葡聚糖、甘露聚糖、葡甘聚糖以及β-葡聚糖等[5]。

木聚糖是半纖維素中含量最豐富的成分，相對而言利用率較低，因此其作為可持續產品開發的重要生物資源而備受關注[6]。木聚糖廣泛存在于秸稈、麥麩、玉米芯、甘蔗渣、果蔬等農副產品加工殘余物中。木聚糖酶解產生木糖、木寡糖、阿拉伯糖、阿魏酸等多種生理活性成分，廣泛應用于功能性食品、飲料、烘焙等食品行業中。并且，以木糖等酶解產物為前體可進一步合成木糖醇、阿拉伯糖醇、香蘭素等食品添加劑[7]。木聚糖大多為異質結構，由β-D-吡喃木糖基組成主鏈，側鏈含有不同類型的取代基。因此，木聚糖高效降解往往需要多種水解酶的協同作用。其中，內切木聚糖酶通過隨機切割木聚糖內部的木糖糖苷鍵來攻擊主鏈結構，其產物木寡糖被β-木糖苷酶進一步水解生成木糖單體。此外，木聚糖復雜的側鏈組成需要額外的側鏈水解酶，如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶等。然而，木聚糖水解過程中酶的種類和用量的高需求及降解方式的低效率導致多種酶投放成本較高，這也是木聚糖高效生物轉化的主要瓶頸[8]。多功能酶在一條多肽鏈中同時具備多種活性，具有“一酶多能”的特點。木聚糖酶解體系中多功能酶的應用是降低成本的有效策略，此外，多功能水解酶在降解木聚糖復雜底物方面具有潛在的協同作用，因此具有廣闊的應用前景[9]。作者將首先介紹木聚糖的結構組成及水解酶系，進而主要從酶的結構與功能方面系統綜述多功能木聚糖水解酶的研究進展及其在食品領域中潛在的應用，最后展望該領域的發展前景。

1 木聚糖的結構組成及水解酶系

1.1 木聚糖的結構組成

木聚糖是一種復雜的異質性多糖，根據木聚糖側鏈糖殘基的類型不同分為：同型木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯葡糖醛酸木聚糖和葡糖醛酸阿拉伯木聚糖（見圖1）[10]。同型木聚糖是一種由木糖殘基組成的非支化木聚糖，根據糖苷鍵的不同分為β-1，4-木聚糖、β-1，3-木聚糖、混合型β-1，3/1，4-木聚糖，廣泛存在于綠藻等植物中[11]；葡糖醛酸木聚糖是含有α-1，2 連接的葡糖醛酸基和4-O-甲基葡糖醛酸基取代的木聚糖，主要存在于雙子葉植物中[12]；阿拉伯木聚糖是指D-木糖殘基的C2/C3 位連有L-阿拉伯呋喃糖取代基的β-1，4-木聚糖，主要存在于谷物中[13]；其他兩種類型的木聚糖，即阿拉伯葡糖醛酸木聚糖和葡糖醛酸阿拉伯木聚糖，含有甲基葡糖醛酸殘基和L-阿拉伯呋喃糖殘基，分別連接在主鏈β-1，4-木糖殘基的C2 和C3位置，這兩個術語有時可以互換，但L-阿拉伯呋喃糖與糖醛酸的比例較低的聚合物常被稱為葡糖醛酸阿拉伯木聚糖[14]。此外，木聚糖中的L-阿拉伯呋喃糖基單元可以進一步在C5 位被羥基肉桂酸酯（即阿魏酸和對香豆酸）取代[13]。

圖1 木聚糖的結構組成Fig.1 Structural composition of xylan

1.2 木聚糖水解酶系

木聚糖完全水解需要多種酶協同發揮作用，包括主鏈水解酶β-1，4-內切木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、還原端外切木聚糖酶，以及側鏈水解酶α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶等。由于木聚糖水解酶成員的分類、催化位點、作用機制等特征已有相關文獻進行總結[6，15-17]，在此不逐一贅述。木聚糖水解酶系存在于兩個家族：糖苷水解酶（GH）家族和碳水化合物酯酶（CE）家族（見表1）[16，18-24]。

表1 木聚糖水解酶成員及其底物特異性Table 1 Xylanolytic enzyme members and their substrate specificity

2 多功能木聚糖水解酶

2.1 多功能木聚糖水解酶概述

多功能酶在酶蛋白的一條多肽鏈中同時具有兩種或兩種以上催化活性，可催化復雜的連續反應或多底物反應體系。在催化過程中，可能會有多個中間狀態存在，這使得多功能酶表現出更高催化效率的特性。首先，第一個活性位點的產物可以主動或被動地直接通過底物通道轉移到另一個活性中心，通道的“門控”作用有助于維持多個活性部位反應的精確同步，以最大限度地減少中間體的積累；其次，第一個反應的活性位點的狀態可能影響第二個反應的活性位點的動力學特性，反之亦然[25-26]。同時，多功能酶往往具有良好的調控性，能夠在不同催化條件下表現出不同的活性。多功能酶在進化上是由編碼功能相關的基因融合而形成。推測復雜的多功能酶是由簡單的單功能酶進化而來，催化活性相關的基因可以由共同的調控元件控制[27-28]。

木聚糖是一種復雜的異質性多糖，其多種側鏈取代基的存在會形成空間位阻，使木聚糖難以被完全降解且酶解效率較低。因此，需要多酶協同催化來消除側鏈的阻礙作用，使木聚糖主鏈更容易接近木聚糖酶的活性中心，進而提高木聚糖的降解效率[8，29]。然而，不同單酶的催化特性之間存在差異，且多酶催化體系在實際應用中往往面臨著成本高、工藝復雜、重復利用率低等諸多挑戰，因此，多功能酶對于低成本、高效木聚糖酶解體系的構建具有重要意義。根據結構域與催化功能的特點，木聚糖水解酶系主要分為兩類：1）單催化結構域的多功能木聚糖水解酶，一條多肽鏈上僅有一個催化結構域，可通過一個或多個活性中心/位點催化不同的反應進而發揮多種作用，部分包含其他的輔助結構域（如碳水化合物結合模塊[CBM]、纖維連接蛋白III[Fn3]等）對催化結構域的功能起調控作用；2）多催化結構域的多功能木聚糖水解酶，一條多肽鏈上存在多個催化結構域模塊，各自具有不同的活性中心，不同結構域之間由柔性連接區（linker）或其他非催化結構域相連（見圖2）。

圖2 多功能木聚糖水解酶分類Fig.2 Classification of multifunctional xylanolytic enzyme

2.2 單催化結構域的多功能木聚糖水解酶

這一類多功能木聚糖水解酶僅含有一個獨立的催化結構域催化不同的底物反應。根據其活性位點的位置，進一步可細分為單活性位點型、多活性位點型多功能木聚糖水解酶。

2.2.1 單活性位點型多功能木聚糖水解酶 單活性位點型多功能木聚糖水解酶在單一結構域中具有底物識別的泛雜性（promiscuity），通過相同的活性中心殘基催化不同的底物。根據CAZy 數據庫分析，具有多種底物特異性的木聚糖水解酶家族主要包括GH3、5、7、9、10、11、13、30、31、43、44、48 等。例如，GH30 家族的多功能木聚糖水解酶來自亞家族7，包括內切葡糖醛酸木聚糖酶和外切木二糖水解酶。該類酶的雙功能分子機制已得到解析。Nakamichi 等報道解纖維素藍狀菌（Talaromyces cellulolyticus）來源的TcXyn30B 能夠有效地將葡糖醛酸木聚糖轉化為低聚木糖，進一步在低聚木糖的非還原端切割釋放木糖單體[30-31]。與GH30 亞家族8來源的單功能葡糖醛酸木聚糖酶結構相比，TcXyn30B（PDB：6IUJ）中保守的Arg46 用于識別葡糖醛酸基側鏈，對于內切木聚糖酶的活性十分關鍵；而活性中心附近的額外插入片段β2～α2 柔性環（loop）上的Asn93 用于識別低聚木糖的非還原端，對于外切木二糖水解酶活性很重要（見圖3）。類似地，Nikolaivits 等解析 了嗜熱 毀絲霉 菌（Thermothelomyces thermophila）來源的TtXyn30A及與產物復合體（PDB：7O0E）的晶體結構，該酶含有GH30 家族典型的TIM 桶型催化結構域和一個由9 條β 鏈組成的較小結構域（β9 結構域）[32]。β9 結構域中的第一條β 鏈位于催化結構域的N 端，而其余8 條β 鏈位于C 端，表明該結構域對于催化結構域的穩定折疊十分關鍵。生化分析表明該結構域不能與所測定的多糖結合，其功能還有待闡明。與TcXyn30B 相比，TtXyn30A 中同樣存在額外的插入片段，對于木二糖水解酶活性很重要，而保守的Arg34 盡管對酶活力很重要，但并不直接介導與葡糖醛酸基側鏈的識別，這與其他已報道的GH30 木聚糖水解酶不同。該研究不僅拓展了GH30 雙功能木聚糖水解酶的生物技術應用，還為研究單功能酶轉變為多功能酶的分子決定因素提供了一個良好的范例。GH43 家族主要作用于木聚糖側鏈，發揮β-木糖苷酶和（或）阿拉伯呋喃糖苷酶功能，部分成員具有多功能性。Liu 等報道了來源于短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus TCCC 11350）的嗜冷酶rXYL，同時具有木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶兩種活性。序列比對顯示rXYL 包含木糖苷酶保守的催化氨基酸Asp14、Asp127、Arg287。該酶在30 ℃活力最高，在4 ℃和0 ℃條件下分別維持其最大活力的26%和18%，且具有相對較強的木糖耐受性。此外，rXYL與內切木聚糖酶在低溫下連續或同時降解山毛櫸木聚糖顯示出較高的協同效應（分別為11.14 倍和16.21 倍）[33]。然而，該酶識別木糖苷和阿拉伯呋喃糖苷底物的分子機制尚不清楚，有待進一步探索。Basit 等報道了嗜熱毀絲霉菌（Thermothelomyces thermophila）來源的TtXy43，僅含有單獨的GH43 家族催化結構域，但同時具有內切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶3 種活性，可以將木聚糖高效降解生成木糖單體[34]。具有的3 種活性共用相同的催化氨基酸Asp134 和Glu228，并且3 種活性在相似的催化條件下發揮功能。結構模擬和分子對接顯示，TtXyn43 的活性位點形成狹長的底物結合口袋以容納較長的木聚糖底物進入，Glu176、Asp85 和Asp38 對于底物識別起到關鍵作用。Rohman 等報道了喜熱噬油芽孢桿菌（Geobacillus thermoleovorans IT-08）來源的Xyl，含有GH43 家族催化結構域和β-三明治輔助結構域，同時具有β-木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的活性，兩種活性共用相同的催化氨基酸Asp14 和Glu177[35]。通過解析Xyl 單體（PDB：5Z5D）及其與產物復合體（PDB：5Z5I）結構發現，該酶的活性中心位于催化結構域漏斗狀中心空腔，可以容納木糖和阿拉伯糖兩個糖基單元，分別位于底物結合口袋-1 和+1 亞位點。Asp121、His238、Arg269 對于識別阿拉伯糖基發揮重要的作用，保守的Glu198 對于識別木糖基起著重要的作用。此外，其他GH 家族的單催化結構域多功能木聚糖水解酶的作用機制也有一定的報道。例如，Tong 等報道了嗜熱細菌（Dictyoglomus turgidum）來源的GH3 家族木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶Dt-2286，序列比對得出其催化氨基酸為Asp276 和Glu507[36]。重組Dt-2286 在搖瓶大腸桿菌中β-木糖苷酶的表達量高達270 U/mL，該酶的最適反應條件為pH 5.0、98 ℃，且該酶具有較高的熱穩定性和有機溶劑的耐受性，與內切木聚糖酶協同作用于木聚糖，可釋放高達15.08 倍的還原糖。Bouraoui 等從突尼斯溫泉細菌中分離出僅含有GH51 家族催化結構域多功能酶THSAbf，該酶對pNPAf 具有較高活力（kcat/Km=1 050 L/（mmol·s）），且可以水解樺木和山毛櫸中的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖及甜菜來源的線性及分支阿拉伯聚糖[37]。阿拉伯呋喃糖苷酶和內切木聚糖酶的催化氨基酸相同（Glu177 和Glu296），且兩種活性在60 ℃下和較寬的pH 范圍（pH 4.0～7.0）內較為穩定。結構模擬和分子對接發現，THSAbf 具有較寬的活性位點裂縫用于發揮多種功能。此研究對簡化及構建成本低、效率高的木聚糖水解酶復配體系具有重要的意義。

圖3 TcXyn30B 的晶體結構Fig.3 Crystal structure of TcXyn30B

Hameleers 等從海貍糞便基因組中鑒定到雙功能乙酰木聚糖酯酶/阿魏酸酯酶BD-FAE，僅包含單獨的CE 結構域，被歸類于一個新的具有廣泛底物特異性的酯酶家族[38]。該酶不僅水解樺木來源的乙酰葡糖醛酸木聚糖（AcGX）釋放乙酸，發揮乙酰木聚糖酯酶功能；還能從玉米纖維來源的乙酰基和阿魏酰基高度取代的低聚木糖（AcFaXOS）中釋放阿魏酸，發揮阿魏酸酯酶功能。BD-FAE 的晶體結構（PDB：6TKX）顯示其采取典型的α/β 水解酶折疊構象，活性中心包含保守的催化三聯體Ser128、Asp237、His269。活性位點附近存在一個暴露于溶劑中的較淺凹槽，在空間上可以與高度取代的較大底物結合。此外，Dilokpimol 等研究了10 種真菌來源的新型CE1 酶，其中，CE1 亞家族2 的瘤孢棒囊孢殼（Corynascus sepedonium）Fxe1和嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）FxeA 以及CE1 亞家族5 的球毛殼菌（Chaetomium globosum）Fxe1 具有阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶雙重活性，能夠從小麥阿拉伯木聚糖中同等程度地釋放乙酸和阿魏酸[39]。結構模擬顯示催化位點附近的氨基酸變化可能決定其不同的底物識別特異性：具有嚴格乙酰木聚糖酯酶活性CE1 亞家族1 中保守的Trp，在具有雙功能的CE1 亞家族2 中被較小側鏈的殘基（Ala、Pro、Ser、Thr 等）取代，允許其在催化位點結合較大的底物阿魏酸；而與同家族的阿魏酸酯酶相比，CE1 亞家族5 的CgFxe1 存在獨特的Thr226 可能與乙酰基形成相互作用，從而促進其雙重活性。

此外，還有一些單活性位點單催化結構域水解酶不僅降解木聚糖，還能催化其他多糖底物水解。例如，Wang 等從木聚糖降解菌株芽孢桿菌（Bacillus sp.KW1）中鑒定出GH10 家族耐熱酶XynA，該酶不僅可以水解木聚糖類底物，而且對微晶纖維素、羧甲基纖維素（CMC）、對硝基苯纖維二糖苷（pNPC）、對硝基苯基吡喃葡萄糖苷（pNPG）等纖維素類底物具有水解活性[40]。Phakeenuya 等報道了來源于解凝乳類芽孢桿菌（Paenibacillus curdlanolyticus B-6）的GH9 家族的 多功能 酶PcMulGH9，具有廣泛水解纖維素、甘露聚糖、木聚糖中β-1，4 糖苷鍵的能力[41]。Liu 等報道了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis BS-5）來源的GH13 家族α-淀粉酶/內切葡聚糖酶/內切木聚糖酶BSGH13[42]，以及Han 等報道了嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）來源的GH7 家族具有纖維二糖水解酶和木聚糖酶活性的耐熱酶Ctcel7 等[43]。此類多功能酶具有多種復雜底物的降解能力，對其適應條件和作用機理的研究為工業化應用奠定基礎。

2.2.2 多活性位點型多功能木聚糖水解酶 多活性位點型多功能木聚糖水解酶在單一催化結構域中含有不同的催化中心，各自催化不同的反應，具有“兼職”（moonlighting）酶的特征。與單活性位點型多功能木聚糖水解酶相比，這一類酶的研究較少。Cao 等報道的熱解纖維素菌（Caldicellulosiruptor lactoaceticus）來源的乙酰酯酶/木糖苷酶CLH10 是一類特殊的雙功能木聚糖水解酶[44]。在一級序列上，CLH10 的酯酶與糖苷酶保守序列片段呈混合型分布，不能被歸類于某一家族。結構研究顯示其具有獨立的木糖苷酶和乙酰酯酶活性位點，分居催化結構域的兩側，互不干擾。CLH10 結構整體（PDB：6A6O）呈現典型的酯酶構象，具有保守的催化三聯體，在其背側的柔性環偶然進化形成一個糖苷酶活性中心，從而實現對乙酰酯和木糖苷底物的識別與催化。該研究顯示位于蛋白質表面的環狀區可以作為蛋白質工程潛在位點，用于設計和產生具有新型多功能酶催化劑（見圖4）。此外，Shahid 等從嗜酸纖維素分解菌（Acidothermus cellulolyticus 11B）中挖掘到GH10 家族的內切木聚糖酶/阿拉伯呋喃糖苷酶/乙酰木聚糖酯酶XynB，能夠水解多種木聚糖天然底物產生木糖、木二糖、阿拉伯糖、乙酸[45]。該酶包含一個GH10 催化結構域和兩個纖維素結合結構域CBM2、CBM3，與不溶性木聚糖相比，兩個CBM 的存在使其對膠體微晶纖維素具有更高的結合力。該酶在70 ℃和pH 6.0 時具有最佳活性，且在高達70 ℃時保持穩定。這些特性使其具有極大的工業化應用潛力。然而，該酶通過單一GH10 結構域催化糖苷鍵和酯鍵水解的分子機制尚不清楚，亟待深入探索。

圖4 CLH10 的晶體結構Fig.4 Crystal structure of CLH10

2.3 多催化結構域的多功能木聚糖水解酶

這一類多功能木聚糖水解酶典型特征為含有多個催化結構域模塊，不同的催化結構域通過各自的催化位點執行不同的功能，不同催化結構域之間與其他結構域或柔性環構成的連接區相連。多催化結構域多功能木聚糖水解酶大多包含GH 和CE 催化結構域，可以同時水解糖苷鍵與酯鍵。Yang 等從產黃青霉（Penicillium chrysogenum P33）中挖掘到含CE1 和GH62 催化結構域的雙功能乙酰木聚糖酯酶/阿拉伯呋喃糖苷酶PcAxe，兩種酶在相似條件下發揮功能，最適pH 均為7.0，乙酰木聚糖酯酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的最適溫度分別為40 ℃和50 ℃，且在廣泛pH 范圍下穩定，并具有金屬離子耐受性[46]。PcAxe 與重組木聚糖酶協同水解脫木質素玉米秸稈，協同度高達1.35，且用等量的PcAxe 代替商用纖維素酶，脫木質素玉米秸稈中葡萄糖的釋放量提高了51%，顯示出較高的纖維素水解效率，表明該酶具有良好的應用前景。類似地，Mroueh 等從解纖維梭菌（Ruminiclostridium cellulolyticum）中挖掘到阿拉伯呋喃糖苷酶/乙酰木聚糖酯酶（GH62-CE6-1240）[47]。該酶包含GH62 和CE6 雙催化結構域，可催化不溶性小麥阿拉伯木聚糖的脫乙酰化和阿拉伯糖基的水解，且對阿拉伯聚糖（I 型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖的一種成分）也有活性，表明其參與了果膠的降解。因此，GH62-CE6-1240 在植物細胞壁多糖的降解中起關鍵作用。Wang 等從高效降解玉米秸稈的細菌菌群EMSD5 中挖掘到雙功能內切木聚糖酶/阿魏酸酯酶rXyn10A/Fae1A，可以同時作用于木聚糖的主鏈和側鏈[48]。該酶包含GH10 和CE1 雙催化結構域和CBM2 和CBM13 碳水化合物結合模塊。兩種酶的最適溫度均為50 ℃，木聚糖酶和阿魏酸酯酶的最適pH 分別為6.0 和7.0，兩種酶均在較寬的pH 范圍內較為穩定。生化分析顯示，僅含有CE1 催化結構域的截短體具有較低的阿魏酸酯酶活性，而同時含有CE1-GH10 催化結構域的截短體使阿魏酸的產量顯著增加，但僅為全長蛋白質產阿魏酸總量的78%，表明處在同一多肽鏈上的不同催化結構域對阿魏酸的釋放具有分子內協同效應。rXyn10A/Fae1A 能夠從農業廢棄物中產生高達2.78 mg/g 的阿魏酸和160.5 mg/g 的木糖/低聚木糖，顯示出巨大的應用潛力。Kmezik 等從多毛擬桿菌（Bacteroides eggerthii）多糖利用位點（PUL）27 中鑒定到含雙催化結構域CE15 和GH8 的葡糖醛酸酯酶/外切木聚糖酶BeCE15A-Rex8A，酶學分析發現，N 端的CE15 葡糖醛酸酯酶結構域對葡糖醛酸酯酶（GE）模式底物活性較差，可能與活性位點附近關鍵氨基酸的替換有關；而C 端GH8 外切木聚糖酶結構域可以從低聚木糖的還原端釋放木糖單體，但對較長的木聚糖鏈沒有活性。全長蛋白質和單獨GH8 結構域分別與商用GH11 木聚糖酶協同催化玉米芯，結果發現木寡糖的含量均得到了明顯的提升，但并未觀察到兩個結構域間的協同效應[49]。該研究報道的CE15-GH8 的結構域組成非常罕見，同時強調了針對PUL 的基因挖掘對于發現新酶類型與結構具有重要意義。Pereira 等從人體腸道結腸擬桿菌中挖掘到阿魏酸酯酶/乙酰酯酶Bi1040-FAE，能夠從阿魏酰酯化的寡糖、去淀粉麥麩、不溶性小麥阿拉伯木聚糖中釋放阿魏酸，也可以水解乙酰化燕麥木聚糖釋放乙酸[50]。由于該酶的表達量較低，通過序列比對獲得了多毛擬桿菌來源的BeGH43/FAE。該酶N 端為GH43 家族融合蛋白質序列，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性；C 端為Bi1040-FAE 同源蛋白質，具有乙酰酯酶和阿魏酸酯酶的活性。結構解析（PDB：6LMY）顯示，BeGH43/FAE 的GH43 結構域具有典型的五葉片β-螺旋槳結構和β-三明治型結構，活性中心具有保守的催化氨基酸Asp149 和Asp38；酯酶結構域呈現保守的α/β 水解酶折疊構象，具有保守的催化三聯體Ser634、His774、Asp742（見圖5）。分子動力學模擬顯示BeGH43/FAE 的酯酶結構域具有較大的底物結合口袋和更高的底物可及性，可以容納較大的阿魏酸酯類底物。這類融合阿拉伯呋喃糖苷酶和酯酶活性的多結構域多功能酶可以提高復雜阿拉伯木聚糖的降解效率，有助于腸道菌降解膳食纖維釋放阿魏酸。

圖5 BeGH43/FAE 的晶體結構Fig.5 Crystal structure of BeGH43/FAE

具有多個CE 催化結構域的木聚糖水解酶也有報道。Kmezik 等報道了營發酵單胞菌（Dysgonomonas mossii）來源的雙功能乙酰酯酶/阿魏酸酯酶DmCE1B，含有兩個CE1 催化結構域和中間的CBM48 結構域[51]。生化研究顯示，包含N 端CE1和CBM48 的截短體（DmCE1B_nt）同時具有乙酰酯酶和阿魏酸酯酶的活性，與全長蛋白質活性相似；而C 端CE1 和CBM48 截短體（DmCE1B_ct）僅具有較低的阿魏酸酯酶活性。DmCE1B_ct（PDB：7B5V）的結構解析顯示，其具有10 鏈組成的β-三明治型CBM48 結構域和酯酶典型的α/β 水解酶折疊結構，中間由一個較短的10 個氨基酸組成的連接區相連。酯酶保 守的催 化三聯 體（Ser542、His638、Glu606）位于CE1 和CBM48 結構域之間的凹槽中，底物阿魏酸甲酯位于活性中心凹槽的邊緣，與催化絲氨酸距離較遠。然而，由于全長及具有雙重活性的DmCE1B_nt 的結構尚未報道，該酶實現雙功能的分子基礎以及不同結構域對全長蛋白質的調控機制并不清楚，有待進一步探索。

此外，Kmezik 等也從卵形擬桿菌（Bacteroides ovatus）和約氏黃桿菌（Flavobacterium johnsoniae）中鑒定到兩種具有相似結構域組成的酯酶，包含N 端的CE6 結構域和C 端的CE1 結構域[52]。其中CE6表現出乙酰酯酶活性，而CE1 表現出阿魏酸酯酶活性。這兩種酶可以顯著提高商用木聚糖酶水解玉米芯（接近2 倍）和日本山毛櫸（超過20 倍）的能力。并且，與添加兩個分離的單催化結構域相比，全長蛋白質協同商用木聚糖酶水解天然木聚糖底物的能力顯著提升，表明兩個酯酶結構域之間存在分子內協同作用，這種協同增強效應的分子機制尚待闡明。此類多功能酶是改善生物質有效降解的重要工具，在食品、飼料、造紙等工業生產中具有廣闊的應用前景。

此外，還有一些研究著重分析催化結構域之間的連接區或其他結構域對酶催化功能的影響。例如，Krska 等從極端嗜熱厭氧菌（Caldicellulosiruptor kristjanssonii）中挖掘到多模塊嗜熱雙功能酶CkXyn10C-GE15A，該酶包含N 端的兩個CBM22、內切木聚糖酶和葡糖醛酸酯酶催化結構域和中間的3 個CBM9，以及C 端的鈣黏素結構域和兩個SLH 結構域[53-54]。兩種酶活性的最適反應條件存在差異，且兩個催化結構域混合催化天然木聚糖底物時，并未發現明顯的協同效應。5 個碳水化合物結合模塊對不溶性多糖、可溶性多糖、低聚糖具有不同的底物偏好性，并對催化結構域的活性和熱穩定性起促進作用。Holck 等從廢水處理的污泥基因組中鑒定出一種含有3 個催化結構域的阿魏酸酯酶/阿拉伯呋喃糖苷酶/內切木聚糖酶CE1-GH62-GH10，該酶發揮3 種功能時的催化條件存在差異：以不溶性小麥阿拉伯木聚糖為底物測定的GH62、GH10 的最適溫度為45 ℃，CE1 的最適溫度為35 ℃；GH10的最適pH 范圍較寬泛（pH 3.0～8.0），GH62 最適pH 7.0～9.0，CE1 最適pH 10.0～11.0[55]。值得注意的是，全長蛋白質與單催化結構域的等摩爾混合體系相比活性相當，但熱穩定性有一定提高；GH62-GH10對底物的催化效率比單獨的GH10 高2.5 倍，而CE1 需要在GH10 存在的情況下從底物中釋放阿魏酸。幾種多功能木聚糖水解酸特性見表2。

表2 多功能木聚糖水解酶的特性Table 2 Properties of multifunctional xylanolytic enzyme

續表2

3 多功能木聚糖水解酶在食品領域的潛在應用

隨著人們對安全和健康食品需求的不斷增加，研發功能性食品成為了關注的焦點。木聚糖是半纖維素的主要成分，存在于水果和蔬菜的初級細胞壁和膳食纖維中[56-57]，對果汁澄清和面包加工產生影響，可以加入木聚糖水解酶進行改善，從而獲得澄清度和營養成分更高的果汁和蓬松度、口感更好的面包。此外，酶解木聚糖可獲得益生元低聚木糖，作為功能性食品添加劑，具有可降低血液膽固醇、增加鈣吸收、抗氧化、維持胃腸道健康、降低結腸癌風險等功能。以下詳細綜述了木聚糖水解酶在食品領域的研究進展和發展前景。

3.1 果汁澄清

自從確定了果汁的營養價值以來，果汁已成為各年齡段人群中流行的健康飲品，制備優質、有益健康的果汁已成為商業食品行業的焦點。任何果汁的制備都涉及3 個步驟，包括提取、果汁澄清和穩定化。然而，商業果汁生產的主要障礙是半纖維素的存在導致果汁澄清度和產量低、果汁濃縮和巴氏殺菌困難以及商業市場可接受度低。因此，食品公司一直在大力研究果汁澄清的方法從而改善其外觀以及延長儲存時間[58]。早期果汁澄清僅依靠物理和化學方法或超濾技術去除半纖維素，但這些方法無法達到令人滿意的澄清水平，進而有研究發現酶法是提高果汁澄清度的最有效方法。其中，在果汁中加入內切木聚糖酶可有效降解果汁中的多糖，從而提高果汁的澄清度和香氣，延長包裝產品的貯藏壽命。有研究者從日本曲霉（Aspergillus japonicus）中提純了內切木聚糖酶（UFMS 48.136），并成功利用該酶對芒果汁、香蕉汁、橙汁、菠蘿汁和蜜橘汁進行了澄清處理，其澄清度分別達到51.11%、9.99%、2.66%、6.11%和8.54%[59]。此外，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也可用于果汁的澄清，彭程等將黑曲霉（Aspergillus niger）來源的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶加入柚子汁中，其澄清度提高了15.18%[60]。有研究者研究了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和商用內切木聚糖酶的協同加入對蘋果汁、葡萄汁、橙汁和桃汁的作用，結果發現，與兩酶單獨處理相比，兩酶協同加入可提高果汁的產量和澄清度[61]。因此，木聚糖水解酶在果汁澄清中發揮著重要的作用，且兩個單功能木聚糖水解酶在果汁澄清中具有協同作用，但加入兩種酶成本較高，且不同酶的作用條件可能存在差異，操作困難。因此，在果汁加工中，多功能木聚糖水解酶的應用將是未來的發展趨勢，具有廣闊的應用前景。

3.2 烘焙

目前，食品公司投入了大量精力以開發高質量感官的健康產品。例如，在烘焙產品方面，使用酶代替化學品是改善面包黏度、質地和風味的有效途徑。在烘焙加工中，全麥面粉中麩皮的存在會導致面筋蛋白稀釋，從而降低面團和面包的一些關鍵質量屬性，例如面包體積、顏色、質地和味道等。阿拉伯木聚糖是位于小麥胚乳中的非淀粉多糖，占面粉的0.4%～0.8%（質量分數）。雖然質量分數很低，但其具有高吸水性，是影響面團發酵和面包口感等的重要因素。內切木聚糖酶可隨機催化阿拉伯木聚糖主鏈的木糖殘基間的共價鍵，降低平均聚合度，從而改變面團的流變特性、面包的比容和面包屑的硬度等[62-63]。然而，阿拉伯木聚糖含有35%～40%的阿拉伯糖取代基，部分阿拉伯糖取代基含有酯鍵相連的阿魏酸，這些側鏈取代基的存在會阻礙內切木聚糖酶對阿拉伯木聚糖主鏈的水解。因此，需要加入阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶從而提高阿拉伯木聚糖的水解效率，且釋放出低熱量的阿拉伯糖和對人體有益的阿魏酸。已報道嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）產生包含木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的酶混合物，這些酶混合物在長時間溫育后的固態發酵過程中釋放木糖和阿拉伯糖，從而使面包體積增加了22%，而松脆度和支鏈淀粉回生分別減少了25%和17%[64]。此外，Xue 等發現與單獨加入木聚糖酶/阿拉伯呋喃糖苷酶相比，組合加入木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶具有更強的阿拉伯木聚糖水解能力，且對面團流變性質和品質有協同作用[65]。

3.3 低聚木糖的制備

低聚木糖是由多個木糖單元通過β-1，4-木糖苷鍵連接而成的寡聚糖，在結構上，低聚木糖根據構成其化學結構的單體數量以不同的形式存在，包括木二糖、木三糖、木四糖、木戊糖、木己糖等。根據物理化學特性，低聚木糖被歸類為不易消化的低聚糖，在寬泛的溫度范圍（最高達100 ℃）和pH 條件（pH 2.5～8.0）下具有較好的穩定性，是糖尿病患者的功能性食品和膳食甜味劑的理想添加劑[66-68]。此外，低聚木糖可通過免疫刺激增加健康雙歧桿菌（Bifidobacterium）的數量從而改善腸道功能[69]，可能降低患結腸癌的風險，具有益生元作用[70-71]。作為食品成分，低聚木糖具有可接受的氣味和低熱量，并且不會導致齲齒的生成，可用于抗肥胖飲食[72]。目前，低聚木糖的生產主要采用化學法及酶法等。其中，化學法是在高溫高壓下使用酸水解或堿提取獲得低聚木糖，該方法會產生大量的副產物，如糠醛和羥甲基糠醛等，其會降低低聚木糖的益生元特性[73]。然而酶法生產低聚木糖不會產生無用的副產物，且對環境無污染，是食品工業生產低聚木糖的首選方法[74]。Wang 等以200 mg 去淀粉麥麩為底物，通過加入雙功能阿魏酸酯酶/木聚糖酶進行酶解，其低聚木糖（木糖/低聚木糖）產量可達18.2 mg[48]。Li 等通過加入內切木聚糖酶和β-木糖苷酶水解楊木鋸末生產低聚木糖，結果發現當僅加入內切木聚糖酶或β-木糖苷酶時，低聚木糖的產率較低，而當兩種酶協同加入水解時，低聚木糖的產率可高達93.9%[75]。這些研究表明，相比于單獨使用木聚糖酶，采用多功能酶或多酶協同作用于木聚糖分子可以明顯提高木聚糖主鏈的水解效率。隨著人們對功能性食品需求的不斷增加，酶法生產益生元低聚木糖具有很好的市場前景，后續采用低成本、高活性的多功能木聚糖水解酶生產低聚木糖是一種可持續發展的有效策略。

4 展 望

近年來，隨著酶工程技術領域的發展及與食品生物領域的交叉融合，針對食品體系及特殊食品分子的酶催化體系構建成為酶工程研究領域的熱點之一。與傳統的單酶或多酶催化體系相比，兼具多種催化活性的多功能酶在酶解木聚糖等復雜底物時具有降低生產成本、提高催化效率、簡化酶解工藝等明顯優勢。目前，針對天然多功能木聚糖水解酶的挖掘表達、酶學表征和催化機制解析已取得卓有成效的研究進展。然而，由于不同類型的多功能木聚糖水解酶的結構、與底物結合及催化的酶動力學機制較為復雜，對該類酶的分子調控機制仍知之甚少，尚未實現工業化應用。未來的研究可以從以下方面展開：1）通過木質纖維素降解優勢菌群的多組學研究和生物信息數據挖掘技術，篩選和挖掘具有更好酶學特性的新型多功能木聚糖水解酶；2）通過序列比對、結構解析等研究手段，更加全面深入地探索不同類型多功能木聚糖水解酶催化分子機制，同時使用定向進化和祖先序列重建探索酶系統，進一步了解酶進化分子機制，特別是探究單酶同時發揮多種功能的分子基礎；3）通過理性設計、定向進化等方法改變酶的分子結構以提高催化活性及熱穩定性，如在活性中心引入新的殘基可以改變酶與底物的靜電相互作用，通過活性位點周圍氨基酸的改造將天然單功能酶進化為多功能酶等；4）基于酶學機制的高效融合多功能木聚糖水解酶的人工構建與修飾，目前人工構建融合酶的過程中經常存在錯誤折疊、功能或結構干擾、蛋白質間連接器斷裂等問題，后續可以嘗試將更穩定的酶放在融合酶的前端從而克服上述問題，此外，使用翻譯后修飾位點如N-乙酰化或糖基化位點可以提高酶的穩定性；5）結合人工智能技術精確指導特異性天然多功能酶篩選與精準設計，通過多學科的綜合交叉研究，解決高效食品酶創制中的共性關鍵問題，進而定制更符合工業需要的多功能酶催化體系，推動相關產業的快速發展。