海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球固定化柚苷酶的研究

于曉婷，陳曉藝，李 苗，王淑婧，王添譽，李 僉，李憲臻

（大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034）

酶是一種生物催化劑，因其擁有綠色、環保和可持續發展的優勢而受到廣泛關注。但是，由于其物理和化學特性的不穩定，使得在實際使用中不能長時間維持其催化活性，因而不能充分發揮其催化作用[1]。酶固定化技術是通過采用合適的固定化工藝，將游離酶固定到易于循環利用的載體上，固定化材料、制備方法、酶用量以及固定化條件等皆會影響酶的固定化效果[2]。

從1910 年開始，隨著新型固定化載體的不斷涌現，固定化酶領域發展迅速。載體通常需要根據固定化酶的應用要求進行選擇[3]。固定化酶常用的載體可以分為以下4 類：無機載體（二氧化硅、活性炭等[4]）、天然有機物（纖維素、殼聚糖、海藻酸鈉等[5-6]）、合成高分子材料（環氧樹脂、聚丙烯腈膜等[7]）和復合載體（有機物質與無機物質混合構成的載體，例如磁性復合微球等[8]）。常用的固定化酶方法有以下幾種：1）吸附法是指通過范德華力作用，酶和載體進行結合，但是這樣的力常常不是很強，造成酶和載體之間反應不夠牢固，在使用時，酶很容易脫落進入反應溶液中，造成回收困難[9]。2）交聯法是通過兩種或多種功能的交聯劑，將酶分子和載體連接起來的固定化方式。為了避免酶從載體上掉落，通常不單獨使用交聯法，而與包埋法或吸附法組合應用[10]。3）共價偶聯法（又稱為共價結合法）是通過在酶和載體之間形成共價鍵來固定酶的一種工藝。和其他方法相比，該方法反應條件較復雜，不僅在一定程度上會引起酶蛋白在空間上特定結構的變化，還有可能破壞酶的活性中心，從而導致酶活力降低。

柚皮苷是一種二氫類黃酮化合物，口感苦澀，在柑橘類果品中十分常見。為了改善其苦澀味道，柚苷酶通常用于去除柚柑類產品（如果汁等）的苦味[11]。柚苷酶是一種復合酶，具有α-L-鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40）和β-D-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）兩種活性[12-14]，其在自然界中的動物、植物、微生物中普遍存在[13]。柚苷酶水解柚皮苷主要經過兩個步驟：第一步，柚皮苷經過α-L-鼠李糖苷酶水解為α-L-鼠李糖和普魯寧兩種物質，普魯寧的苦味遠低于柚皮苷（其苦味值僅為柚皮苷的一半）；第二步，普魯寧被β-D-葡萄糖苷酶水解生成葡萄糖及柚皮素，這兩種產物均沒有苦味[14]。迄今為止，柚苷酶在柑橘類水果脫苦、葡萄酒調味、醫藥工業等方面發揮著重要作用[15-18]。

在已有固定化柚苷酶的報道中，殼聚糖是一種較為常用的固定化載體，是廣泛存在于自然界的天然高分子物質，具有生物相容性好[19]、安全無毒、易降解等優點[20]。段志濤等分別用殼聚糖和海藻酸鈉微球對柚苷酶進行共價鍵合，其酶比活力分別為14.34 U/g 和12.18 U/g[21]。此外，作為殼聚糖的衍生物，羧甲基殼聚糖是將羧甲基等基團加入到殼聚糖的內部，其中富含大量的羧基和氨基等功能基團，在中性和堿性條件下，水溶性較好，因此有效改善了殼聚糖的溶解性能[22]。并且與單純的殼聚糖材料相比較，羧甲基殼聚糖表現出更優異的生物相容性，同時能夠與Ca2+交聯產生致密結構，對活性化合物的吸附和控制釋放有非常好的效果。肖安風等用聚乙烯醇和海藻酸鈉形成的復合材料進行固定化柚苷酶的相關研究，酶比活力達到19 U/g[23]。與此同時，海藻酸鈉也是一種天然多糖類物質，同樣可以與Ca2+交聯形成網絡結[24]。雖然海藻酸鹽微球羥基和羧基含量豐富，但由于其強度不高，導致微球結構相對不穩定，最好引入一些無機載體來增強其機械強度，例如二氧化硅，是最受歡迎的無機載體之一，具有良好的物理和機械穩定性，無膨脹，耐有機物、高酸度和高溫等顯著優點[25]。與此同時，海藻酸鈉、硅膠、羧甲基殼聚糖均為綠色、對環境友好、價格相對便宜的原料，能夠有效降低工業化生產成本。

迄今為止，鮮有關于羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉引入硅膠為材料對柚苷酶進行固定化的報道，作者以羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、硅膠為基材制備微球，對柚苷酶進行固定化，優化了硅膠/羧甲基殼聚糖質量比、交聯時間、固定化溫度、偶聯時間等條件，并探索和分析了固定化柚苷酶和游離柚苷酶發生酶解反應的最適反應pH、最適反應溫度、重復使用性等，為創新酶固定化載體，不斷拓寬柚苷酶在食品、醫藥等領域的應用和發展提供了技術準備和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設備

DENVER INSTRUMENT TP-213 精密天平：美國丹佛儀器有限公司產品；78-1 型磁力加熱攪拌器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產品；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司產品；知楚三層立式搖床：上海知楚儀器有限公司產品；PHS-3C 型pH 計：上海儀電科學儀器股份有限公司產品；HH-8 型恒溫水浴鍋：常州菲普實驗儀器廠產品；Tecan 酶標儀：勒菲生物科技（上海）有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 微球載體及固定化柚苷酶的制備

1）滴入法制備海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球 首先配制1.5 g/dL 海藻酸鈉溶液（溶液A），將100 mL 去離子水和1.5 g 海藻酸鈉加入到250 mL 的燒杯中，置于磁力加熱攪拌器上進行攪拌至溶解后，再加入1.0 g 硅膠和1.5 g 羧甲基殼聚糖，繼續劇烈攪拌待其形成均一溶液后停止。配制2 g/dL CaCl2溶液（溶液B），稱取4 g CaCl2于燒杯中加水溶解，轉移到200 mL 容量瓶中定容。將溶液B 轉移至三口燒瓶中，加入磁子后，將其置于恒溫加熱磁力攪拌器上，在溫度為25 ℃條件下進行低速攪拌。利用1 mL 的注射器將溶液A 緩慢逐滴加入到溶液B 中，滴入瞬間在溶液B 中可以看到生成的微球，注意滴入速度不能過快，防止微球粘連。溶液A 全部加入后，微球濾出加入新的CaCl2溶液，同樣的低轉速持續攪拌1 h，結束后，用去離子水將微球洗滌數次。最后，將微球平鋪在濾紙上，吸干其表面水分，4 ℃冷藏。

2）戊二醛交聯海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球的制備 將0.4 g 上述微球放入到1 mL 體積分數為6%的戊二醛溶液中，在25 ℃搖床中交聯2.0 h。反應結束后，用去離子水洗滌數次，將微球平鋪在濾紙上，吸干其表面水分，即得到戊二醛交聯的海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球，冷藏備用。

3）固定化柚苷酶的制備 取0.4 g 已交聯的微球載體，加入4 mL 柚苷酶酶液，置于25 ℃搖床上振蕩2 h，并于4 ℃冰箱中靜置吸附偶聯4 h。用去離子水清洗數次，將載體表面未固定化的剩余酶液沖洗干凈，濾紙吸干水分獲得固定化柚苷酶，于4 ℃冰箱中儲存備用。

1.3.2 酶學性質表征

提高學生學習興趣，可幫助學生改善學習效率，并使生物成績快速提升。在教學實踐中，教師可通過引導學生觀察大自然的方式提升學生對于生物課程的興趣。首先教師可利用假期時間，邀請學生進入到大自然中開展活動，在活動中，教師可開展相關的生物實驗，以幫助學生認識到大自然的魅力與生物的多樣性。之后教師可組織學生在課堂中將活動的體會進行分享。通過這樣的活動學生將對自然環境產生新的認識，并將在教師的引導下對生物課程產生較為濃厚的興趣。

1）酶解反應條件的優化 研究了海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球固定化柚苷酶酶解反應溫度、最適反應pH、pH 穩定性以及熱穩定性。通過測定4 ℃、30 d 內酶活力變化，研究了固定化柚苷酶的儲藏穩定性，同時計算了固定化柚苷酶的載酶率和酶活力回收率。

2）酶活力的測定 選擇改進的Davis 法[26-29]，稱取0.4 g 固定化柚苷酶或移取0.2 mL 游離柚苷酶于1.5 mL 離心管中，加入0.8 mL 的柚皮苷溶液（0.8 mg/mL），混合均勻并置于恒溫水浴鍋中，在溫度為55 ℃條件下加熱30 min，反應停止后，取0.1 mL 上清液，加入到提前配制好的溶液C（體積分數95%一縮二乙二醇5 mL 和4 mol/L 氫氧化鈉0.1 mL）中，振蕩混勻，待其反應10 min 后，在波長為420 nm 條件下測定OD 值。

柚苷酶酶活力：在最適反應pH 和最適反應溫度條件下，在1 min 內酶解質量為1 μg 的柚皮苷所需要的酶量稱作一個酶活力單位，其單位為U。

酶比活力：在最適反應pH 和最適反應溫度條件下，1 g 固定化柚苷酶或1 mL 游離柚苷酶具有的酶活力，其單位為U/g 或U/mL。

3）相關計算公式[30]固定化柚苷酶的載酶率由下式（1）計算得出：

式中：B 為載酶率，%；A0為柚苷酶固定前游離柚苷酶的總酶活力；A1為柚苷酶固定后上清液中剩余的酶活力。

酶活力回收率由下式（2）計算得出：

式中：R 為酶活力回收率，%；A2為固定化柚苷酶的總酶活力。

固定化柚苷酶相對酶活力計算公式如下式（3）：

式中：Q 為相對酶活力，%；P 為某一條件下的酶活力；K 為該條件下的最高酶活力。

1.3.3 動力學參數測定 取0.2 mL 游離柚苷酶，加入0.8 mL 柚皮苷溶液中（質量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL），在pH 為4.5，溫度為55 ℃條件下，進行酶解反應，測定酶活力；取40 mg 固定化柚苷酶，加入0.8 mL 柚皮苷溶液中（質量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL），在pH 為7.5、溫度為55 ℃條件下，進行酶解反應，測定酶活力。最大反應速度（Vmax）和表觀米氏常數（Km）由Lineweaver-Burk 方程計算得出，如下式（4）：

2 結果與分析

2.1 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球制備工藝的優化

2.1.1 硅膠/羧甲基殼聚糖質量比對固定化柚苷酶酶活力的影響 首先，研究了硅膠/羧甲基殼聚糖質量比對固定化柚苷酶酶活力的影響，結果如圖1（a）所示。當硅膠/羧甲基殼聚糖質量比為1.0∶1.5 時，酶活力達到最大值。當羧甲基殼聚糖質量增大時，酶活力隨之減小，這可能是由于微球通過靜電作用形成了復雜的空間網狀結構[31]，當羧甲基殼聚糖含量過高時，所產生的微球結構相對牢固，壁膜結構致密[32]，減少了酶分子與載體結合的位點數量。因此，采用硅膠/羧甲基殼聚糖的質量比1.0∶1.5 進行后續實驗。如圖1（b）所示，在最佳工藝條件下制備出了機械強度高、表面光滑且成球性好的海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球。

圖1 硅膠/羧甲基殼聚糖質量比對固定化柚苷酶酶活力的影響及最佳條件下制備的固定化材料Fig.1 Effect of silica gel/carboxymethyl chitosan mass ratio on the activity of immobilized naringinase and immobilized materials prepared under the optimum conditions

2.1.2 交聯時間對固定化柚苷酶酶活力的影響 作者以海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球為載體，進行固定化柚苷酶。結果如圖2 所示，載體加入戊二醛溶液后，交聯時間在1.0～3.0 h 時，交聯反應2.0 h 達到最大酶活力，這是因為交聯時間過短，會引起酶的脫落[33]；交聯時間過長，會造成過高交聯度，使微球內部網狀結構孔徑過小，不利于酶促反應進行，所以交聯時間超過2.0 h 后，固定化柚苷酶的酶活力會明顯降低。綜上所述，采用2.0 h 作為交聯時間進行后續研究。

圖2 交聯時間對固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.2 Effect of crosslinking time on the activity of immobilized naringinase

2.2 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球固定化柚苷酶的工藝研究

2.2.1 固定化溫度對固定化柚苷酶酶活力的影響 由圖3 可以看出，當固定化溫度在20～40 ℃時，固定化柚苷酶最佳的固定化溫度為25 ℃，酶活力達到最高；大于25 ℃后，酶活力隨之下降，溫度對于柚苷酶的性質影響較大，酶分子的構象由此可能發生變化，導致游離柚苷酶酶活力下降，不能與載體更好地進行結合，進而使固定化柚苷酶的酶活力下降。故選擇25 ℃為柚苷酶的最佳固定化溫度。

圖3 固定化溫度對固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.3 Effect of immobilization temperature on the activity of immobilized naringinase

2.2.2 偶聯時間對固定化柚苷酶酶活力的影響將已交聯的海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球與柚苷酶酶液充分混合并使其結合，因其孔道中存在大量的活性基團，可以使酶分子與載體逐步連接。由圖4 可以看出，當交聯時間小于4 h 時，偶聯時間越長，固定化柚苷酶酶活力越大，在4 h 時達到最高；偶聯時間大于4 h 時，酶活力隨時間的延長不增反而降低。這是由于偶聯時間過長材料表面的酶分子過于聚集，形成立體效應，致使酶分子不能與底物充分接觸，從而使酶活力下降；同時，一部分酶分子深入到載體微球的孔隙中，致使底物難以和孔道內部的酶進一步反應，導致酶活力降低[34]。

圖4 偶聯時間對固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.4 Effect of coupling time on the activity of immobilized naringinase

2.2.3 給酶量對固定化柚苷酶酶活力的影響 如圖5 所示，一定范圍內，固定化柚苷酶的酶活力隨著給酶量的增加逐漸增加，當給酶量為465.6 U/mL時，酶活力達到最高，之后隨著給酶量進一步增加，酶活力降低。這是因為當給酶量為465.6 U/mL 時，載體的反應位點可能被酶分子完全占據，而給酶量的進一步增加，會使過多酶分子通過擠壓現有酶分子覆蓋的孔位置來擴大其與載體的連接[35]，致使酶和底物不能進一步發生反應，最終導致酶活力降低。作者所在研究團隊前期對固定化柚苷酶的相關研究及其他相關文獻中也出現了類似的實驗規 律[12，21，35-41]。

圖5 給酶量對固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on the activity of immobilized naringinase

2.3 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球固定化柚苷酶酶學性質的研究

2.3.1 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球固定化柚苷酶的最適反應pH 及pH 穩定性 如圖6（a）所示，游離柚苷酶在pH 為3.0～6.0 時，酶活力變化比較大，在pH 為6.0 時僅剩余32%的酶活力，當pH 為8.0 時酶活力非常低（接近于0）；而固定化柚苷酶在pH 為4.5～8.0 時，一直保持46%以上的酶活力。與游離柚苷酶相比，固定化柚苷酶有更好的耐堿性，且隨pH 的增加，變化趨勢較為緩和。

固定化柚苷酶的最適反應pH 與材料性能及其所在的微環境有較大關系。本研究中，固定化柚苷酶的最適pH 向堿性方向發生了偏移，這可能是由于羧甲基殼聚糖帶有游離氨基，為陽離子型載體，當柚苷酶被固定在微球上時，表面會帶有一定的負電荷，從而吸附溶液中的部分陽離子特別是氫離子[42]，使固定化柚苷酶擴散層的氫離子濃度稍高于外部溶液，即呈弱酸性，因此外部溶液的pH（即固定化柚苷酶的最佳pH）需要調節為弱堿性（即pH為7.5，如圖6（a）所示），才能抵消微環境的作用[43]。作者所在研究團隊在前期工作中制備了多種固定化柚苷酶，其中部分固定化柚苷酶的最佳pH 在4.5～5.5[12，36-37]，主要應用于一些酸性柚柑果汁的脫苦處理和酒類增香等；另外一部分固定化柚苷酶的最佳pH 在7.0～8.0[38-40]，可用于堿性醫藥中間體（如普魯寧等）的制備。進一步結合柚苷酶具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶兩種酶活性的特性，固定化柚苷酶的最適反應pH 變化較大，非但不會限制柚苷酶的應用，反而在很大程度上拓寬了其在食品和醫藥方面的應用范圍。

同時，在圖6（b）中可以看出，將固定化柚苷酶和游離柚苷酶分別加入到pH 為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中。將其放在4 ℃冰箱內保存2 h，測定酶活力。固定化柚苷酶酶活力的變化比游離柚苷酶的緩和，說明固定化柚苷酶比游離柚苷酶具有更好的pH 穩定性。

圖6 游離柚苷酶和固定化柚苷酶的最適反應pH 和pH 穩定性Fig.6 Optimum reaction pH and pH stability of free enzyme and immobilized naringinase

2.3.2 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球固定化柚苷酶的最適反應溫度及熱穩定性 如圖7（a）所示，固定化柚苷酶和游離柚苷酶的酶活力均隨著反應溫度的升高表現出先上升后下降的趨勢。游離柚苷酶和固定化柚苷酶的最適反應溫度均為55 ℃，但當溫度在40～65 ℃時，固定化柚苷酶酶活力保持在80%以上，而游離柚苷酶在溫度低于45 ℃和高于60 ℃時酶活力小于80%。與此同時，由圖7（b）可以看出，將固定化柚苷酶和游離柚苷酶，同時置于55 ℃的恒溫水浴鍋內反應0、2、4、6、8 h，分別測其酶活力。與游離柚苷酶相對比，隨著時間的變化，固定化柚苷酶的酶活力變化更緩和，故固定化柚苷酶比游離柚苷酶表現出更優異的熱穩定性。

圖7 游離柚苷酶和固定化柚苷酶的最適反應溫度和熱穩定性Fig.7 Optimum reaction temperature and thermal stability of free enzyme and immobilized naringinase

2.3.3 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球固定化柚苷酶的儲藏穩定性 如圖8 所示，固定化柚苷酶在4 ℃的條件下儲藏30 d 后，仍然剩余70%以上的酶活力；而游離柚苷酶在儲藏期間酶活力顯著降低，在儲藏15 d 后酶活力迅速下降，保存30 d 后只剩余25%的酶活力。結果表明，固定化柚苷酶比游離柚苷酶具有更好的儲藏穩定性[44]，尤其是在酶需要長時間保存和長距離運輸上有巨大的潛力。

圖8 固定化柚苷酶的儲藏穩定性Fig.8 Storage stability of immobilized naringinase

2.4 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球固定化柚苷酶的載酶率、酶活力回收率及重復使用性

在最佳條件下，利用海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球對柚苷酶進行固定化，其酶比活力、載酶率和酶活力回收率分別為203.33 U/g、36.80%以及62.15%。同時，在弱堿性條件下（pH 為7.5），固定化柚苷酶經過3 次重復使用后，仍能保持46.90%的初始酶活力，比作者所在團隊之前研究中固定化柚苷酶在堿性條件下制備普魯寧的實驗結果（pH為8.0 時，經過3 次重復使用后，固定化柚苷酶的酶活力剩余38.80%[40]）有顯著提高。這也在很大程度上表明，堿性條件下應用固定化柚苷酶進行催化反應的難度始終較大，但是對于制備堿性醫藥中間體（如普魯寧等）具有十分重要的研究意義，需要進一步突破研究瓶頸。

2.5 動力學參數的研究

游離柚苷酶與固定化柚苷酶酶解反應的雙倒數曲線如圖9 所示。經計算，固定化柚苷酶水解柚皮苷的Km值為0.94 g/L，高于游離柚苷酶水解柚皮苷的Km值（0.81 g/L），可以得出，相對于游離柚苷酶而言，固定化柚苷酶對柚皮苷的親和力更低；海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球固定化柚苷酶與底物發生酶解反應的最大反應速率Vmax（0.51 g/（L·min））比游離柚苷酶水解反應的Vmax（1.88 g/（L·min））小，這是因為固定化柚苷酶具有空間效應，使底物難以與酶接觸，進而使得酶促反應速率下降[45]。進一步由Vmax=kcat[E]可得kcat=Vmax/[E]，固定化柚苷酶的最大反應速率Vmax雖然比游離柚苷酶小，但固定化柚苷酶的[E]也比游離柚苷酶小得多，實驗結果顯示，固定化柚苷酶與游離柚苷酶對底物降解的kcat值分別為1.41 min-1和1.33 min-1，表明固定化柚苷酶具有更高的催化效率。

圖9 游離柚苷酶與固定化柚苷酶酶解反應的雙倒數曲線Fig.9 Double reciprocal curve of enzymatic hydrolysis of free naringinase and immobilized naringinase

3 結語

以海藻酸鈉、羧甲基殼聚糖及硅膠為原材料制備的微球為載體，以體積分數為6%的戊二醛作交聯劑，對柚苷酶進行固定化。結果表明，最佳固定化條件：硅膠/羧甲基殼聚糖微球質量比1.0∶1.5、交聯時間2.0 h、最佳固定化溫度25 ℃、偶聯時間4 h、給酶量465.6 U/mL，此時海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球固定化柚苷酶的酶比活力、載酶率和酶活力回 收率分別為 203.33 U/g、36.80% 以 及62.15%。同時，固定化柚苷酶在弱堿性條件下，循環利用3 次之后，依然剩余46.90%的酶活力，在制備堿性醫藥中間體（如普魯寧等）方面具有較大的應用潛力。另外，對海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復合微球固定化柚苷酶的酶學性質研究結果顯示，相比游離柚苷酶，固定化柚苷酶對pH 和溫度都表現出更好的穩定性，具有良好的操作穩定性和儲藏穩定性。作者將羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉引入硅膠作為載體進行柚苷酶的固定化研究，所取得的實驗結果為創新酶固定化載體，進一步拓寬柚苷酶在食品、醫藥等領域的應用和發展提供了充分的技術準備和數據支持。