真菌毒素降解酶及其在飼料與食品行業(yè)中的研究現(xiàn)狀

徐 煒，張玉磊，施 妍，方媛媛，歐陽斌斌，張文立，沐萬孟*，2

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

真菌毒素的發(fā)現(xiàn)要追溯到11 世紀(jì)歐洲的 “麥角中毒”事件。真菌毒素主要是由絲狀真菌如鐮刀菌屬、曲霉屬和青霉菌屬產(chǎn)生的次生代謝物。真菌毒素一般理化性質(zhì)穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)難以破壞，可以通過食物鏈進(jìn)行累計(jì)富集，從而危害到動(dòng)物和人類的健康安全，產(chǎn)生一系列的生殖毒性、免疫毒性、遺傳毒性和致癌毒性。例如玉米赤霉烯酮被證明具有肝毒性、血液毒性、生殖毒性、免疫毒性和遺傳毒性。谷物、種子和水果中存在真菌毒素會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并對農(nóng)業(yè)和食物鏈構(gòu)成重大威脅，進(jìn)而對人類健康構(gòu)成威脅。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）的調(diào)查顯示，世界上每年約有25%的農(nóng)作物被真菌毒素污染，給全球造成了近千億美元的經(jīng)濟(jì)損失[1]。早在2006 年，歐盟（European Union，EU）就實(shí)施了食品真菌毒素法規(guī)委員會(huì)條例并且對食品中真菌毒素的最高含量進(jìn)行了明確規(guī)定。因此，如何最大限度地減少真菌毒素一直是飼料和食品行業(yè)的一個(gè)重要且全球性的話題。

物理方法可以去除一些真菌毒素，但必需營養(yǎng)素的非特異性結(jié)合禁止其進(jìn)一步應(yīng)用。由于潛在的毒性、較高的成本和可能的二次污染，化學(xué)方法也受到限制。近年來，生物脫毒相比于物理化學(xué)法愈加展現(xiàn)其強(qiáng)大的優(yōu)勢，其中的生物酶法脫毒更是吸引了廣泛的關(guān)注。生物酶法在僅添加蛋白質(zhì)及少量綠色因子的情況下，便能夠高效降解真菌毒素，降解程度高，且最終產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物毒性更低?；诖耍髡邔I吐毒素、玉米赤酶烯酮、黃曲霉毒素、伏馬毒素、赭曲霉毒素、展青霉毒素6 種常見真菌毒素的降解酶及其在飼料與食品行業(yè)中的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述（見圖1）。

圖1 真菌毒素降解酶從“實(shí)驗(yàn)”走向“實(shí)際”Fig.1 Mycotoxins degrading enzymes from "laboratory" to "practice"

1 嘔吐毒素

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又稱嘔吐毒素，因其會(huì)引起人類和動(dòng)物的腹瀉、嘔吐和胃腸道炎癥而得名。低劑量的DON 攝入會(huì)造成動(dòng)物的腸道屏障損傷和免疫刺激，高劑量攝入時(shí)會(huì)引起嘔吐，導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率降低等。能夠產(chǎn)生嘔吐毒素的菌屬主要包括鏈孢菌屬（Alternaria Nees）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢菌屬（Cladosporium）、鐮刀菌屬（Fusarium）和青霉屬（Penicillium）[2]，其中鐮刀菌屬是最主要的菌屬。DON 通常在農(nóng)作物采后和儲(chǔ)存過程中產(chǎn)生，常出現(xiàn)于世界各地被污染的食品和飼料中，尤其在玉米中的發(fā)生率較高。

由于很難在農(nóng)作物生長環(huán)節(jié)中完全避免DON的產(chǎn)生，因此近年來人們圍繞作物加工和儲(chǔ)存環(huán)節(jié)開展了一系列有關(guān)DON 解毒的工作。目前，利用微生物吸附、降解或使用酶法降解對DON 進(jìn)行生物解毒，具有巨大的應(yīng)用潛力。其中，酶法降解DON因反應(yīng)條件溫和、降解率高等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。研究報(bào)道，DON 中主要的致毒基團(tuán)是C3 位的羥基和C12～C13 位的環(huán)氧結(jié)構(gòu)（見圖2）[3-4]。因此酶法消除DON 的主要作用位點(diǎn)是C3 羥基以及C12～C13 位的環(huán)氧基團(tuán)[5]。

圖2 嘔吐毒素的結(jié)構(gòu)簡式及相應(yīng)的酶解基團(tuán)Fig.2 Chemical structure of DON and the corresponding degradation groups

1.1 C12～C13 環(huán)氧結(jié)構(gòu)的DON 降解

有關(guān)DON 的C12～C13 環(huán)氧結(jié)構(gòu)的降解或修飾作用的降解酶鮮有報(bào)道。其中，來自米曲霉（Aspergillus oryzae）As-W.6 的培養(yǎng)液被發(fā)現(xiàn)含有一種脂肪酶，且純化后的脂肪酶可以將不同濃度的DON 降解70%[6]。高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）分析結(jié)果顯示，降解產(chǎn)物比DON 的相對分子質(zhì)量減少了13.9，表明生成了一種新的物質(zhì)。盡管對C12～C13 環(huán)氧結(jié)構(gòu)進(jìn)行降解的酶報(bào)道很少，但作用于該位置的DON 降解菌卻很多。如Fuchs 等發(fā)現(xiàn)從牛瘤胃分離的細(xì)菌菌株BBSH 797 可以將DON 降解為DOM-1；不但如此，與DON 結(jié)構(gòu)類似的6 種不同的A 型毛霉烯族毒素液均能被該菌株降解[7]。Gao等從雞腸道中鑒定出一株新的毛霉烯氧化細(xì)菌Eggerthella sp.DII-9。在溫度20～45 ℃和pH 5～10時(shí)，該菌生長狀態(tài)良好，并能夠?qū)ON 轉(zhuǎn)化為DOM-1，且同樣對之前提到的DON 同族毒素具有光譜降解效果[8]。該團(tuán)隊(duì)還篩選得到一株革蘭氏陽性無孢子菌Slackia sp.D-G6，該菌株不僅可以將DON 降解為DOM-1，還可以高效的產(chǎn)生雌激素，能有效預(yù)防雌激素依賴以及年齡相關(guān)的疾病[9]。

1.2 C3 位羥基的DON 降解

針對DON 的C3 位羥基有兩種降解的途徑。一種是氧化C3 位羥基，生成相應(yīng)的酮基，即3-酮-DON（3-keto-DON）；另一種是將C3 位羥基異構(gòu)化，形成3-羥基-DON（3-epi-DON）。He 等從麥田中分離到一株能夠降解DON 的細(xì)菌菌株鞘氨醇單胞菌S3-4（Sphingomonas S3-4）[10]。通過與其他可降解DON 菌株的基因組序列進(jìn)行比較分析，結(jié)合鞘氨醇單胞菌S3-4 基因組BAC 文庫的功能篩選，發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌S3-4 菌株中主要是一個(gè)羥酮還原酶家族成員AKR18A1 負(fù)責(zé)將DON 氧化為3-keto-DON。隨后該酶成功在大腸桿菌（Escherichia coli）中實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)，重組后的AKR18A1 降解DON 的最適pH 為9.5，在此條件下該酶的最大反應(yīng)速率為（25.7±0.8）nmol/（min·mg）。該酶在pH 10～11 時(shí)可以保持70%的相對酶活力，顯示出良好的堿穩(wěn)定性。AKR18A1 的降解反應(yīng)依賴輔因子煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADP+），但是在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）存在的情況下，AKR18A1 也能夠催化3-keto-DON 的逆反應(yīng)生成DON。隨后，He 等發(fā)現(xiàn)德沃斯氏菌D6-9（Devosia mutans D6-9）能夠?qū)ON分解為3-keto-DON 和3-epi-DON。通過對德沃斯氏菌D6-9 進(jìn)行基因組分析，共確定了3 個(gè)與DON異構(gòu)化反應(yīng)有關(guān)的基因，其編碼的蛋白質(zhì)一個(gè)是醌依賴的DON 脫氫酶QDDH，負(fù)責(zé)將DON 氧化為3-keto-DON[11]，以及另外兩個(gè)分別為NADPH 依賴的aldo/keto 還原酶AKR13B2 和AKR6D1，負(fù)責(zé)將3-keto-DON 轉(zhuǎn)化為3-epi-DON。利用大腸桿菌獲得重組蛋白質(zhì)QDDH、AKR13B2 和AKR6D1，并對小麥籽粒中的DON 進(jìn)行降解，可以觀察到6 h 內(nèi)DON 被完全降解成3-keto-DON 和3-epi-DON。Carere 等通過對DON 降解菌德沃斯氏菌17-2-E-8（Devosia mutans 17-2-E-8）的RNA 進(jìn)行測序和比較，推測該菌株中可能同時(shí)存在兩種DON 降解酶。一種是吡咯喹啉醌（PQQ）依賴的脫氫酶DepA，可以將DON 降解為3-keto-DON。另外一種蛋白酶則負(fù)責(zé)將3-keto-DON 進(jìn)一步還原為3-epi-DON[12]。隨后，又在Devosia mutans 17-2-E-8 中純化出了DepB，證實(shí)了DepB 是一種NADPH 依賴的脫氫酶，該酶的最適溫度為30 ℃，最適pH 為7.5，且在pH為7～8 時(shí)能夠保持較高的降解率[13]。

Qin 等通過對耐鹽遠(yuǎn)洋桿菌 ANSP101（Pelagibacterium halotolerans ANSP101）、德沃斯氏菌17-2-E-8 和德沃斯氏菌IFO13580 三株菌進(jìn)行基因組分析，發(fā)現(xiàn)一種來自耐鹽遠(yuǎn)洋桿菌ANSP101的喹諾酮類蛋白質(zhì)，并命名為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇脫氫酶（DDH）[14]。DDH 可以在氫受體吩嗪甲硫酸酯（PMS）或二氯酚苯酚（DCPIP）為輔因子的前體下將DON 氧化成3-keto-DON。通過與德沃斯氏菌17-2-E-8 和德沃斯氏菌D6-9 的醌依賴脫氫酶DepA序列比對，發(fā)現(xiàn)了DDH 中兩個(gè)顯著影響DON 降解的關(guān)鍵氨基酸殘基，分別為第478 位的絲氨酸和第480 位的谷氨酸。徐建宏等研究了DON 降解菌Devosia sp.DDS-1 產(chǎn)生的3-乙酰-DON（3-ACDON）氧化酶的酶學(xué)特性。該酶的最適溫度為35 ℃，最適pH 為7.0，且在pH 為7～9 時(shí)可以保持80%的相對酶活力。同時(shí)，結(jié)果表明大多數(shù)金屬離子在濃度為0.2～2.0 mmol/L 時(shí)，對3-AC-DON 氧化酶有促進(jìn)作用，而乙二胺四乙酸（EDTA）對該酶活性有抑制作用[15]。不同微生物來源的DON 降解酶及性質(zhì)比較如表1 所示[10-15]。

表1 不同微生物來源的DON 降解酶及其性質(zhì)比較Table 1 Comparison of DON degradation enzymes from different microorganisms and their properties

2 玉米赤酶烯酮

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是一類由鐮刀菌屬（Fusarium）產(chǎn)生的真菌毒素，廣泛分布于種植玉米、小麥、大麥和高粱的農(nóng)田及糧食副產(chǎn)品中，會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物的大量減產(chǎn)[16-17]。ZEN 具有一個(gè)二羥基苯甲酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，并且根據(jù)其內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)中C1和C6 位的官能團(tuán)差異，ZEN 還擁有另外5 種結(jié)構(gòu)衍生物，分別包括α/β-玉米赤霉烯醇（α/βzearalenol，α/β -ZOL）、α/β-玉米赤霉醇（α/β -zearalanol，α/β-ZAL）和玉米赤霉酮（zearalanone，ZAN），其中α-ZOL 和α-ZAL 具有比ZEN 更高的毒性。隨著食物鏈的不斷累積，ZEN 及其衍生物不僅會(huì)造成嚴(yán)重的農(nóng)作物污染，而且嚴(yán)重威脅到人類的身體健康，構(gòu)成了世界性食品安全問題[18-19]。作為一種真菌毒素，ZEN 已經(jīng)被證明具有肝毒性、血液毒性、免疫毒性和遺傳毒性。Gao 等通過小鼠實(shí)驗(yàn)表明接觸ZEN 會(huì)破壞通過激素相關(guān)基因調(diào)節(jié)的生殖激素和睪丸發(fā)育的系統(tǒng)[20]。目前圍繞ZEN 的降解思路主要是利用內(nèi)酯酶或漆酶破壞ZEN 的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，輔以C6’酮基和C2 或C4 羥基的氧化或修飾（見圖3）。

圖3 玉米赤酶烯酮的結(jié)構(gòu)簡式及相應(yīng)的酶解基團(tuán)Fig.3 Chemical structure of ZEN and the corresponding depradation groups

2.1 內(nèi)酯酶對ZEN 的降解

2002 年，有研究者在粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）IFO 7063 中發(fā)現(xiàn)了一段能夠降解ZEN 的關(guān)鍵基因，并成功純化到了該基因編碼的目的蛋白質(zhì)。然后，基于純化蛋白質(zhì)的序列，將該基因克隆到大腸桿菌中，并命名為ZHD101[21]。隨后，ZHD101 分別在裂殖酵母（Schizwosaccharomyces pombe）和畢赤酵母中成功實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，并且檢測到了ZEN 降解活性。這是首次報(bào)道的ZEN 降解酶，并且該基因序列早在2002 年已經(jīng)被申請專利保護(hù)。隨后，將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)（EGFP）基因與ZHD101 融合并在大腸桿菌中表達(dá)，并觀測到表達(dá)后的重組蛋白質(zhì)（EGFP：ZHD101）與改造前的ZHD101 降解效果接近。同時(shí)，在不同的pH 條件下，EGFP：ZHD101 的熒光強(qiáng)度和反應(yīng)速度表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，為實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測ZHD101 體內(nèi)降解ZEN 的效率提供了一定的研究思路[22]。Yang 等通過將編碼ZHD101 的基因克隆到大腸桿菌和乳酸桿菌穿梭載體pNZ3004中，然后通過電穿孔獲得重組質(zhì)粒pNZ-ZHD101，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到從肉雞胃腸道分離的益生菌乳酸桿菌中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化后的菌株獲得了降解ZEN的能力[23]。值得注意的是，重組ZHD101 在生產(chǎn)過程中并沒有對細(xì)胞生長、耐酸性和膽鹽耐受性產(chǎn)生明顯的副作用。

隨著研究的不斷深入，其他微生物中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了潛在的ZEN 內(nèi)酯酶。如Zhang 等從紅粘帚霉（Gliocladium roseum）克隆得到了一種內(nèi)酯酶可以高效地降解ZEN，命名為ZENG[24]。重組ZENG 的最適pH 為7.0，最適溫度為38 ℃，同時(shí)ZENG 對ZEN、α-ZOL 和α-ZAL 都有較高的降解率。Hui 等挖掘出了一種ZHD101 同源的蛋白質(zhì)，稱為CbZHD。序列比對表明，CbZHD 具有與ZHD101 相同的催化三聯(lián)體“S-H-E”，而催化三聯(lián)體主要用于和ZEN 之間的相互作用。CbZHD 的最適溫度和最適pH 分別為35 ℃和8.0[25]。Zhang 等發(fā)現(xiàn)了3 種新的具有降解ZEN 能力的內(nèi)酯酶CLA、EXO 和TRI，分別與ZHD101 有著61%、63%和97%的氨基酸同源性[26]。Bi 等鑒定了一種紅面包霉菌（Neurospora crassa）來源的內(nèi)酯酶ZENC，具有較高的酶活力。除此之外還將ZENC 應(yīng)用于3 種不同的動(dòng)物飼料中。結(jié)果表明，當(dāng)分別在酒糟、玉米副產(chǎn)物和玉米皮中添加800 U 的ZENC 時(shí)，ZEN 的濃度分別降低了70.9%、88.9%和94.7%[27]。Yu 等分離了一種新的內(nèi)酯酶ZHD607，并通過結(jié)構(gòu)和序列比對分析，得到了活性分別是ZHD607 的2.9 倍和3.4 倍的突變體[28]。Wang 等純化重組了一種與ZHD101 有65%的氨基酸同源性的內(nèi)酯酶ZHD518，可以降解ZEN 及其衍生物等多種真菌毒素[29]。隨后，對其進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的鑒定和活性位點(diǎn)改造，并設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變株N156H，該突變體對α-ZOL 的降解活性提高至原始酶的3.3 倍。

2.2 其他酶對ZEN 的降解

Wang 等首次研究了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）來源的BsCotA 漆酶降解ZEN 和AFB1的能力[30]。在以丁香酸甲酯作為介質(zhì)時(shí)，該酶對ZEN 和AFB1降解率分別為98%和100%。Loi 等在體外實(shí)驗(yàn)中評估了杏鮑菇（Pleurotus eryngii）來源的漆酶（Ery4）和漆酶介體系統(tǒng)（LMSs）對多種毒素的降解作 用[31]。其中，AFB1和ZEN在一起 降解時(shí)，P.eryngii Ery4 對這兩種毒素的降解率分別為86%和100%。Yu 等克隆了來自不動(dòng)桿菌SM04 中的一個(gè)過氧化還原酶（Prx）基因，并成功在大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)了重組表達(dá)[32]。重組的Prx 在H2O2存在時(shí)可以有效降解ZEN，同時(shí)對ZEN 的最適降解pH 和降解溫度分別為9.0 和70 ℃。將該酶與H2O2共處理6 h 后，可以降解90%的ZEN。Qin 等鑒定出了一種來自熱羧鏈霉菌（Streptomyces thermocarboxydus）的多銅氧化酶（StMCO）[33]。StMCO 在與乙酰丁香酮或ABTS 等介體物質(zhì)共存時(shí)對ZEN 和AFB1有較高的降解率。同時(shí)，在沒有介質(zhì)的情況下，StMCO 也可以微弱地降解ZEN 和黃曲霉毒素AFB1。不同微生物來源的ZEN 降解酶及性質(zhì)比較如表2 所示[16，21，24-33]。

表2 不同微生物來源的ZEN 降解酶及其性質(zhì)比較Table 2 Comparison of ZEN degradation enzymes from different microorganisms and their properties

3 黃曲霉毒素

AFs 是由黃曲霉屬菌（Aspergillus section Flavi）產(chǎn)生的次級代謝物[34]，在農(nóng)產(chǎn)品加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存以及食品加工過程中廣泛存在。早在2002 年，AFs 就被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）歸納成一類致癌物。AFs 的存在不僅污染了多種食品和飼料產(chǎn)品[35]，而且造成嚴(yán)重的食品安全問題和巨大的經(jīng)濟(jì)損失[36]。在眾多AFs 中（見圖4），AFB1被研究得最為廣泛，因此作者將主要圍繞AFB1的幾種生物降解酶進(jìn)行介紹。

圖4 二氫吡喃環(huán)型黃曲霉毒素及環(huán)戊烯型黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)簡式及相應(yīng)的酶解基團(tuán)Fig.4 Chemical structure of ciclopentenone and difurocoumarolactone and the functional group corresponding degradation groups

3.1 漆酶對AFB1 的降解

Alberts 等首次探究了白腐真菌來源的漆酶（LSs）應(yīng)用不同介質(zhì)降解AFB1的情況[37]。用1 U/mL的商品制劑處理，30 ℃反應(yīng)3 d 后，底物AFB1的降解率為87.34%。Loi 等利用從平菇中純化到的漆酶Lac2 去直接氧化AFB1，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)存在Lac2 的情況下，最終的降解率為23%。當(dāng)在體系中添加乙酰丁香酮（AS）和2，2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）等氧化還原介體物質(zhì)時(shí)，Lac2 對AFB1的降解率可以大幅提高。其中，添加1 mmol/L 的AS或ABTS 后AFB1的降解率分別從23%提升至42%和45%。值得注意的是，當(dāng)丁香醛（SA）添加量為1 mmol/L 時(shí)，Lac2 的降解率與沒有添加介體物質(zhì)相比，降低了13%。繼續(xù)提高介體物質(zhì)的濃度，當(dāng)添加10 mmol/L 的ABTS、AS 和SA 后，Lac2 對AFB1的降解率又分別提高到了81%、90%和72%[38]。Guo 等分離了地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）ANSB821 來源的漆酶CotA。通過研究發(fā)現(xiàn)，CotA 可以在沒有介體的情況下實(shí)現(xiàn)對AFB1的高效降解，在pH 8.0 和37 ℃下，酶解3 h 和12 h 對AFB1的降解率分別為66%和96%，同時(shí)降解產(chǎn)物被鑒定為AFQ1和epi-AFQ1[39]。

3.2 其他酶對AFB1 的降解

劉大嶺等首次報(bào)道了一種名為ADTZ 的黃曲霉毒素降解酶[40-41]。隨著研究不斷深入，ADTZ 被證明為氧化酶，并更名為AFO[42]。1 mg/mL 的AFO 在28 ℃、30 min 內(nèi)可以 完全降 解150 ng 的AFB1。Wang 等在原毛平革菌（Phanerochaete sordida）中分離出一種錳過氧化物酶（MnP），當(dāng)AFB1質(zhì)量濃度為0.3 μg/mL 時(shí)，該酶可以在24 h 內(nèi)將AFB1降解至14%[43]。Yehia 等同樣報(bào)道了MnP 對AFB1的降解，通過在白腐食用菌平菇培養(yǎng)濾液中純化分離到的MnP，與底物AFB1反應(yīng)48 h 后可以達(dá)到90%的降解率[44]。Xia 等在食品級宿主乳克魯維酵母菌GG7993 中構(gòu)建了3 種不同來源的重組MnP，并通過優(yōu)化找出了其中降解AFB1效率較高的PHCMNP。含有該酶的重組菌株GG799（pKLAC1 Phcmnp）培養(yǎng)上清液可以對花生樣品AFB1的降解率達(dá)90%以上[45]。

Yang 等將變色栓菌（Trametes versicolor）來 源的AFB1降解酶（TV-AFB1D）基因整合到巴斯德畢赤酵母GS115（Pichia pastoris GS115）基因組上，并通過優(yōu)化最適作用條件對AFB1的降解達(dá)到75.9%[46]。Xu 等從玉米、水稻和土壤樣本中富集到的43 個(gè)細(xì)菌中成功篩選得到一株具有高效降解AFB1能力的菌株，即沙氏芽孢桿菌L7（Bacillus shackletonii L7）[47]。通過分離純化，鑒定出沙門氏菌L7 中含有的AFB1降解酶BADH，該酶的最適溫度高達(dá)70 ℃。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Cu2+能夠顯著促進(jìn)BADE 活性，而Zn2+、Mn2+、Mg2+、Li+等離子則會(huì)強(qiáng)烈抑制BADE 的活性[47]。Shu等分離到一株芽孢桿菌（Bacillus velezensis DY3108），并發(fā)現(xiàn)其對AFB1具有很高的降解率（91.5%），且發(fā)揮降解功能的主要成分是該菌的無細(xì)胞上清液[48]。用該上清液處理AFB1的最適溫度和pH 分別為80 ℃和8.0。Xie 等從泛菌（Pantoea sp.T6）中分離出一種外膜蛋白質(zhì)PADE，發(fā)現(xiàn)PADE 可以降解AFB1，反應(yīng)的最適溫度為40 ℃，最適pH為7.0[49]。Song 等研究了銅綠假單胞菌M19（Pseudomonas aeruginosa M19）對黃曲霉毒素B1的生物降解，并鑒定出降解AFB1的關(guān)鍵蛋白質(zhì)PADE[50]。Li 等報(bào)道了一種F420H2 依賴的還原酶MSMEG5998 可以降解AFB1，并且發(fā)現(xiàn)將該蛋白質(zhì)的硫氧還蛋白質(zhì)（Trx）連接可以大幅增強(qiáng)酶的降解活性，Trx 連接的酶在8 h 內(nèi)對AFB1的降解率超過80%[51]。Loi 等鑒定了一種過氧化物酶Rh_DypB，該酶可以高效降解AFB1，在低酶量和低H2O2作用下即可催化AFB1羥基化為AFQ1[52]。不同微生物來源的AFB1降解酶及其性質(zhì)如表3 所示[16，33,37-39,42-47,50-53]。

表3 不同微生物來源的AFB1 降解酶及其性質(zhì)比較Table 3 Comparison of AFT degradation enzymes from different microorganisms and their properties

續(xù)表3

4 展青霉毒素

展青霉毒素（patulin，PAT），又稱棒曲霉毒素，主要是由青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）等真菌產(chǎn)生的一種耐熱的真菌毒素（見圖5），常見于植物中，且主要污染的農(nóng)作物是蘋果。毒性研究表明，PAT 對小鼠具有致畸、致癌和免疫毒性。除此以外，PAT 還會(huì)影響人類的免疫、神經(jīng)和胃腸道系統(tǒng)[54]。它是蘋果和蘋果衍生產(chǎn)品（如果汁、蘋果酒、果醬和其他兒童食品）中最常見的真菌毒素。生化研究表明，生物合成途徑由大約10 個(gè)步驟組成。其中涉及的基因包括特征酶、調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[55]。因?yàn)槠湮廴痉秶鷱V和有動(dòng)物毒性的特點(diǎn)，挖掘PAT 相關(guān)的降解酶來保障蘋果及其他果蔬作物的安全性具有重要的研究價(jià)值。

圖5 展青酶毒素的結(jié)構(gòu)簡式及相應(yīng)的酶解基團(tuán)Fig.5 Chemical structure of patulin and the corresponding degradation groups

關(guān)于展青霉素降解酶的挖掘，Tang 等報(bào)道了來自粘紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）中的磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶Orotate 對蘋果汁中棒曲霉毒素具有降解作用，通過研究蘋果汁中棒曲霉毒素降解前后的最佳降解條件和理化性質(zhì)的變化發(fā)現(xiàn)，蘋果汁中除了香氣成分和抗壞血酸成分發(fā)生一定變化外，酶降解后的其余各項(xiàng)理化性質(zhì)均無顯著差異[56]。Wang 等研究了卡利比克畢赤酵母（Pichia caribbica）降解PAT 的機(jī)理并發(fā)現(xiàn)了其關(guān)鍵基因翻譯的PcCRG1蛋白質(zhì)，最終體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PcCRG1 蛋白質(zhì)對PAT 的降解能力[57]。Xiao 等研究了豬胰脂肪酶（PPL）對梨汁中PAT 的降解能力以及降解后對梨汁品質(zhì)參數(shù)的影響[58]。通過優(yōu)化不同的PPL 用量、溫度和時(shí)間，最終得出了PPL 的最佳脫毒條件：當(dāng)PPL的質(zhì)量濃度為0.02 g/mL 時(shí)，能夠降解0.375 mg/L的PAT，且降解率可達(dá)到93.4%。同時(shí)，還評價(jià)了PPL 水解對梨汁中不同風(fēng)味物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)PPL的酶解不會(huì)對有機(jī)酸和維生素C 等風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生明顯的改變。Xing 等從陰溝腸桿菌TT-09（Enterobacter cloacae TT-09）中分離鑒定出一種核糖核苷二磷酸還原酶NrdA 同樣對棒曲霉毒素起關(guān)鍵的降解作用[59]。Xing 等繼續(xù)從酵母菌株（Candida guilliermondii）中分離出短鏈脫氫酶（CgSDR）基因，并將其翻譯出的蛋白質(zhì)SDR 成功在大腸桿菌中異源表達(dá)和生產(chǎn)[60]。Dor 等純化出一種PLL 家族的乳糖酶，該酶被發(fā)現(xiàn)可以顯著抑制病原菌在蘋果中的定殖[61]。此外，如果在病原菌感染蘋果之前將純化的乳糖酶添加到菌培養(yǎng)物中，會(huì)導(dǎo)致致病菌中參與PAT 生物合成和真菌細(xì)胞壁生物合成的關(guān)鍵基因表達(dá)量明顯減少。不同微生物來源的PAT 降解酶及其性質(zhì)如表4 所示[56-58，60]。

表4 不同微生物來源的PAT 降解酶及其性質(zhì)比較Table 4 Comparison of PAT degradation enzymes from different microorganisms and their properties

5 伏馬毒素

伏馬毒素（fumonisins，F(xiàn)B）于1988 年首次從串珠鐮刀菌培養(yǎng)液中分離發(fā)現(xiàn)。它是滋生在谷物上的輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides）、串珠鐮刀菌（Fusarium monitiforme）等多種鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的具有水溶性的次級代謝產(chǎn)物。此外部分曲霉菌和彎頸霉菌也被報(bào)道會(huì)產(chǎn)生伏馬毒素，如黑曲霉能在花生、玉米、葡萄等多種農(nóng)作物中產(chǎn)生伏馬毒素[62]。天然伏馬毒素是由丙烷-1，2，3-三羧酸和長鏈氨基多元醇骨架組成的二酯，根據(jù)多氫醇的不同，這類真菌毒素可以分為A、B、C、P 4 個(gè)系列共28 種不同形式的伏馬毒素，其中B 系列（FB1）占70%[2，63]，是污染分布最廣、毒性最強(qiáng)、研究最為廣泛的一種，并且常與其他系列的伏馬毒素（FB2、FB3）共存[64]。伏馬毒素的存在，嚴(yán)重影響包括玉米、小麥、燕麥在內(nèi)的多種谷物及谷物制品的安全性，對人類和動(dòng)物的健康造成巨大威脅。伏馬毒素殘留在食物中進(jìn)入人體，損害人體肝腎功能，刺激和抑制人體免疫系統(tǒng)，會(huì)導(dǎo)致食道癌、肝癌等多種疾病。根據(jù)Qu 等的研究，伏馬毒素的致毒機(jī)理是調(diào)節(jié)鞘脂代謝和誘導(dǎo)氧化應(yīng)激效應(yīng)[65]。伏馬毒素作為二酯化合物，是人體內(nèi)兩種鞘脂——二氫神經(jīng)鞘氨醇（SA）和神經(jīng)鞘氨醇（SO）的結(jié)構(gòu)類似物，而高濃度的FB 會(huì)對神經(jīng)酰胺合成酶產(chǎn)生抑制作用[66]，擾亂鞘磷脂代謝，導(dǎo)致人體細(xì)胞和組織內(nèi)的鞘氨醇累積，最終產(chǎn)生致毒效果[67]。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織規(guī)定，伏馬毒素的每日最大耐受水平為2 μg/kg（以體質(zhì)量計(jì)）[65]。針對伏馬毒素污染的控制，主要通過作物收獲前引入預(yù)防鐮刀菌措施進(jìn)行拮抗，以及農(nóng)作物收獲后在加工過程中使用天然的黏土吸附劑對FB 進(jìn)行吸附。但是，上述兩種方法均無法徹底達(dá)到解毒的效果，并且會(huì)殘留其他物質(zhì)，因此利用生物酶法進(jìn)行高效徹底地降解FB（見圖6）具有重要的研究價(jià)值。

圖6 伏馬毒素的結(jié)構(gòu)簡式及相應(yīng)的酶解基團(tuán)Fig.6 Chemical structure of fumonisins and the corresponding degradation groups

關(guān)于FB 降解酶的挖掘與應(yīng)用，目前所報(bào)道的真菌毒素降解酶及降解菌均較少，只有少數(shù)降解酶被鑒定。FB 降解酶主要為羧酸酯酶，Duvick 等首先在Exophiala spinifera 中發(fā)現(xiàn)了負(fù)責(zé)降解伏馬毒素的關(guān)鍵基因，將這些基因簇在玉米等農(nóng)作物中克隆表達(dá)后，伏馬毒素的含量逐漸減少[68]。Heinl 等研究發(fā)現(xiàn)菌株Sphingopyxis sp.MTA144 中存在兩步酶促反應(yīng)將FB1降解為無毒產(chǎn)物。首先，由基因fumD編碼羧酸酯酶催化水解主鏈上C14 和C5 兩個(gè)三羧酸基團(tuán)并生成中間產(chǎn)物HFB1；其次，由基因fumI 編碼的氨基轉(zhuǎn)移酶將HFB1的C2-氨基轉(zhuǎn)移到底物丙酮酸上，得到終產(chǎn)物2-keto-HFB1。對比2-keto-HFB1與FB1的關(guān)鍵致毒基團(tuán)，發(fā)現(xiàn)最大的變化是在致毒氨基基團(tuán)，因此，作者推測該兩步反應(yīng)的終產(chǎn)物無毒[69]。Doris 等在以上工作的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)FumI（GenBank ACS27061）在大腸桿菌中的異源表達(dá)。通過純化并鑒定了該酶的最適反應(yīng)條件為pH 8.5 和35 ℃，同時(shí)發(fā)現(xiàn)磷酸吡哆醛可提高酶活力，而高濃度鹽則會(huì)抑制酶活性[70]。除了羧酸酯酶，Li 等根據(jù)氨基酸序列同源性、微生物來源和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用生物信息學(xué)技術(shù)從GenBank 中篩選出一種來自鞘氨醇單胞菌屬的羧酸酯酶（FumDSB）。FumDSB 有著與FumD 相似的作用機(jī)制，且可將FB1降解為HFB1（毒性僅為母本化合物的1/10），該酶在最適條件pH 6.0、30 ℃下的比活力可達(dá)1.12 U/mg，同時(shí)具有良好的pH 和熱穩(wěn)定性[71]。Garnham 等從黑曲霉中分離鑒定了一種單胺氧化酶AnFAO，并且發(fā)現(xiàn)AnFAO 可以將FB2氧化脫胺形成FPy2。隨后，成功在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)AnFAO 的重組表達(dá)，并且結(jié)果顯示在不需要添加外源輔因子的前體下，AnFAO 就能將伏馬毒素FB2氧化脫胺[72]。有學(xué)者已于2014 年首次將來自Sphingopyxis sp.MTA144 的天然酯酶開發(fā)為商用FB 脫毒酶制劑FUMzyme，這是第一個(gè)經(jīng)歐盟認(rèn)證能夠?qū)B 生物轉(zhuǎn)化為無毒產(chǎn)物的安全酶制劑[73]。Alberts 等以商品化酶制劑FUMzyme 為基礎(chǔ)，開發(fā)出一種FumDFB 還原法，可以進(jìn)一步擴(kuò)大該酶制劑在整粒燕麥中的應(yīng)用[74]。不同微生物來源的FB 降解酶及其性質(zhì)如表5 所示[69-72]。

表5 不同微生物來源的FB 降解酶及其性質(zhì)比較Table 5 Comparison of FB degradation enzymes from different microorganisms and their properties

6 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素（ochratoxin，OT）主要由赭曲霉屬和數(shù)種青霉屬真菌產(chǎn)生，其衍生物包括A（OTA，見圖7）、B（OTB）、C（OTC）和α（OTα），其中OTA 毒性最強(qiáng)，污染最嚴(yán)重，在小麥、玉米、花生等農(nóng)作物中均可廣泛檢出OT。赭曲霉毒素骨架均由二氫異香豆素基團(tuán)和苯丙氨酸以酰胺鍵連接而成，此外OTA 和OTC 還包含一個(gè)對氯苯酚結(jié)構(gòu)[75]。OTA 是一種白色、無臭、熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的固體結(jié)晶物，水溶性差，溶解于醇、酮和氯仿等有機(jī)溶劑。因其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，OTA 具有很強(qiáng)的熒光特性，即經(jīng)紫外線照射會(huì)呈現(xiàn)綠色熒光[76]。OTA 在酸性條件下極為穩(wěn)定，同時(shí)食品加工中的簡單高溫處理并不能將其去除。OTA 具有免疫毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性和致畸性，而其脂溶性使之易于在動(dòng)物的組織中積累，進(jìn)一步通過食物鏈被人類攝入。OTA 的結(jié)構(gòu)還類似于人體必需氨基酸苯丙氨酸，因而會(huì)競爭性抑制肝腎中的苯丙氨酸羥化酶的作用，抑制相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成[77]。包括中國在內(nèi)的多個(gè)國家和地區(qū)均對OTA檢出做限量規(guī)定：根據(jù)GB 2761—2011，我國各類谷物和豆制品中的OTA 限量為5 μg/kg[78]。歐盟在部分食品中設(shè)定了OTA 限值，為5～50 μg/kg[79]。通過酶促反應(yīng)降解OTA 具有特異性強(qiáng)、降解率高等特點(diǎn)，是目前生物脫OTA 的一大研究熱點(diǎn)。OTA 的酶促降解途徑主要有如下4 種：1）水解酰胺鍵裂解生成OTα 和L-β-苯丙氨酸；2）異香豆素環(huán)脫氯生成OTB，并進(jìn)一步降解為OTβ；3）異香豆素環(huán)羥基化生成赭曲霉毒素對苯二酚（OTHQ）；4）內(nèi)斷裂酯環(huán)生成OTA 內(nèi)酯OP-OTA（與OTA 具有相似毒性）。由于L-β-苯丙氨酸被認(rèn)為是一種無毒化合物，且OTα的半衰期僅為OTA 的1/10，因此水解酰胺鍵生成OTα 和L-β-苯丙氨酸被認(rèn)為是真正實(shí)現(xiàn)了OTA 的解毒[80]。

圖7 赭曲霉毒素A 的結(jié)構(gòu)簡式及相應(yīng)的酶解基團(tuán)Fig.7 Chemical structure of ochratoxin A and the corresponding degradation groups

6.1 肽酶降解OTA

赭曲霉降解酶主要分為Zn2+依賴的金屬羧肽酶CPA（EC 3.4.24）和絲氨酸羧肽酶CPY（EC 3.4.16）。Pitout 等證實(shí)從牛胰腺中分離出來的羧肽酶CPA 可以水解OTA，在25 ℃下的Km值為1.5×10-4mol/L[81]。來自釀酒酵母的羧肽酶CPY 也被發(fā)現(xiàn)可以降解OTA 為OTα，且最適作用條件為pH 5.6 和37 ℃，但該酶的活性較低，經(jīng)過5 d 的孵育后，對OTA 的降解率僅有52%[82]。Zhang 等從糞產(chǎn)堿菌DSM 16503（Alcaligenes faecalis DSM 16503）中純化 出一種OTA 降解酶Af-OTase（GenBank OSZ37025.1）。經(jīng)鑒定該酶屬于M20 肽酶家族，在其活性部位含有兩個(gè)Zn2+，屬于Zn2+依賴酶。該酶在pH 6.5、50 ℃的條件下達(dá)到最佳降解效果，并且表現(xiàn)出良好的pH 穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性[83]。除此之外，有關(guān)OTA 降解酶的分子改造也取得了一定的效果。Azam 等利用基因融合技術(shù)，構(gòu)建了含有玉米赤霉烯酮水解酶ZHD（GenBank AB076037）和羧肽 酶 CP（GenBank KP161493）的融合酶ZHDCP。該酶具有協(xié)同降解OTA 和ZEN 的雙功能活性，且在pH 7.0 和30 ℃下，僅反應(yīng)30 min 便可以完全降解OTA[84]。Xiong 等構(gòu)建了截?cái)嗲半暮托盘栯牡某墒霤PA 突變體（MCPA）。結(jié)果表明，突變體M-CPA 對OTA 的降解率可達(dá)93.36%，較原始酶有了大幅提升[85]。

6.2 其他降解酶

宋佳等同樣從糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis）中分離出一種Co2+和Zn2+依賴的酰胺水解酶，命名為Af-OTd（GenBank：WP_123049291.1），且成功實(shí)現(xiàn)了該酶在大腸桿菌的異源表達(dá)。經(jīng)純化鑒定，該酶的最適反應(yīng)條件為pH 7.5、50 ℃，且在此條件下，該酶對OTA 具有90%以上的降解率[86]。Dobritzsch 等報(bào)道了一種來自黑曲霉的OTA 降解酶（登錄號AAG60585），并命名為OTase，測得該酶的最適反應(yīng)條件為pH 6.0 和60 ℃[87]。Luo 等從嗜酸窄食單胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）中分離出一種能夠高效降解OTA 的酰胺水解酶ADH3（GenBank CP062156.1），重組的ADH3（1.2 mg/mL）可以在90 s 內(nèi)完全去除OTA（50 mg/mL），且具有較強(qiáng)溫度適應(yīng)性，在0～70 ℃均能發(fā)揮一定水解作用[80]。一些其他種類的酶，如脂肪酶、酰胺酶和蛋白酶也被發(fā)現(xiàn)能夠水解OTA。如來自黑曲霉的脂肪酶與50 μg/mL的OTA 反應(yīng)120 min 后，后者被100%降解為OTα和苯丙氨酸[88]。一些商業(yè)上的蛋白酶也可被報(bào)道可以將OTA 水解為OTα，如來自黑曲霉的蛋白酶A和來自豬胰臟的胰腺素。這些酶均在pH 7.5 顯示出很高的水解活性，在與底物反應(yīng)25 h 后可以將1 μg/mL 的OTA 分別降解87.3%和43.4%[89]。Garcia等研究了商業(yè)化的過氧化物酶POD 對模型溶液和實(shí)際啤酒中的OTA 降解效果，發(fā)現(xiàn)降解率分別為64.9%和10.9%[90]。不同微生物來源的OTA 降解酶及其性質(zhì)如表6 所示[80-84,86]。

表6 不同微生物來源的OTA 降解酶及其性質(zhì)比較Table 6 Comparison of OTA degradation enzymes from different microorganisms and their properties

7 展 望

盡管目前已鑒定的真菌毒素降解酶種類已經(jīng)覆蓋到了包括辣根過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶、羧肽酶、脂肪酶、酰胺酶、醌依賴性脫氫酶、醛酮還原酶和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)酯水解酶等在內(nèi)的超10 種生物酶，但是針對真菌毒素降解菌中的特定降解酶鑒定和報(bào)道仍然不足。例如，從牛瘤胃液中分離出的真桿菌（Biomin?BBSH 797）培養(yǎng)物能夠?qū)ON 轉(zhuǎn)化為DOM-1，但尚未確定負(fù)責(zé)這種單端孢菌素降解的特定酶是什么。因此增加真菌毒素代謝物或中間體的組分探究和結(jié)構(gòu)分析對于揭示微生物中的特定降解酶至關(guān)重要。其次，真菌毒素降解酶的大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用需要滿足幾點(diǎn)要求，包括安全性好、有效性高、生產(chǎn)成本低，以及良好的溫度、pH和有機(jī)溶劑耐受性。然而，只有少數(shù)天然酶能夠滿足這些需求。針對真菌毒素降解酶的分子改造已初見成效，如融合表達(dá)玉米赤酶烯酮降解酶ZHD101和錳過氧化物酶PHCMNP 對AFB1和ZEN 顯示出良好的協(xié)同降解能力。然而，目前已知的ZEN 或DON 等真菌毒素降解酶的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)仍然不足。沒有這些結(jié)構(gòu)信息，將無法更好地明確降解酶的降解機(jī)制和反應(yīng)機(jī)理。通過X 射線衍射或計(jì)算機(jī)輔助的分子動(dòng)態(tài)模擬，可以幫助解析降解酶在復(fù)合底物或產(chǎn)物前后結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而更好地指導(dǎo)學(xué)者進(jìn)行酶分子的理性改造。同時(shí)，從“表觀降解”到“內(nèi)在脫毒”，真菌毒素降解酶還需要不斷地進(jìn)行安全性評價(jià)。2014 年5 月，歐盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）首次評估并發(fā)布了商業(yè)伏馬菌素酯酶（FUMzyme?，Biomin GmbH）作為豬技術(shù)飼料添加劑的安全性和有效性。FUMzyme 是一種飼料添加劑，旨在降解用于家禽育肥飼料中的FB。結(jié)果表明，在劑量范圍（40～300 U/kg，以飼料質(zhì)量計(jì)）內(nèi)使用，F(xiàn)UMzyme 對豬是安全的且具備降解飼料內(nèi)目標(biāo)真菌毒素的能力。此外，添加了FUMzyme 的飼料并沒有檢測得出致突變性或遺傳毒性的結(jié)論，表明在豬飼料中使用添加劑FUMzyme對豬肉產(chǎn)品的消費(fèi)者來說是安全的。2022 年1 月，EFSA 對Biomin GmbH 的另一款玉米赤霉烯酮水解酶（ZenA）的使用安全性進(jìn)行了評估。ZenA 是由含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌DSM32731 生產(chǎn)。結(jié)果表明，在飼料中添加ZenA 對所有陸生動(dòng)物物種都是安全的，具體添加量如下（以飼料質(zhì)量計(jì)）：雞100 U/kg，豬200 U/kg，奶牛250 U/kg，小牛犢400 U/kg，狗450 U/kg。然而，受限于毒性數(shù)據(jù)，大多數(shù)真菌毒素降解酶的使用安全性仍然存疑。例如，盡管來自杏鮑菇（PS419，Ery4）的漆酶能夠100%降解0.05 μg/mL 的AFB1，但是沒有關(guān)于Ery4 更多的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，Ery4 無法被進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用于降解AFB1。因此，更多的研究需要集中在真菌毒素降解酶的鑒定、降解酶的分子改造以及降解產(chǎn)物的毒性評價(jià)等方面。相信在不久的將來，真菌毒素降解酶有望出現(xiàn)在飼料和食品行業(yè)中。