超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物結構特性的影響

李海靜，王 松，劉紅玉，夏秀芳,*

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.大莊園肉業集團股份有限公司，黑龍江 綏化 151100）

海參性腺作為海參的內臟，是海參加工過程中的一種副產品。由于加工過程中利用率較低，海參性腺常常被丟棄，不僅會造成資源浪費，而且可能導致環境污染[1]。海參性腺中蛋白質含量極高（約為55%），是優質的動物蛋白質來源[2]。目前，酶解法因酶解后溶液中無有毒化學物質殘留，是提取海參副產物中蛋白質的主要方法[3]。但是傳統的酶解法存在酶解時間長、酶利用率低和底物轉化率低等缺點[4-5]。因此，研發新的加工方法對于提高酶解率至關重要。

超聲波作為一種安全、環保、高效和無毒的新興物理加工技術，已廣泛應用于改善蛋白質的結構特性[6-9]。超聲產生的空化、熱效應和機械效應會破壞蛋白質分子間的氫鍵和疏水相互作用等，使卷曲的蛋白質分子結構展開[10-12]。當蛋白質展開時，會暴露出新的酶解位點，增加底物與酶接觸的機會，從而促進酶解，提高蛋白質利用率[4,13]。此外，超聲預處理導致蛋白結構的展開促使連接蛋白之間的肽鍵更大程度地暴露于酶，增加了酶與肽鍵作用的可能性，進而有利于酶分子與底物接觸并發揮作用[14]。

本研究利用不同時間（0、5、15、25、35 min，200 W）超聲預處理海參性腺蛋白酶解物，探究其側鏈、二級和三級結構、表面疏水性、粒徑和微觀結構等的變化情況，確定出最佳的超聲預處理時間，以期為超聲技術在海參性腺蛋白開發利用方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參性腺 大連水產有限公司；中性蛋白酶（酶活力81 000 U/g） 北京索萊寶科技有限公司。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；721型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；F-4600熒光光譜儀 日本Hitachi公司；MS3000激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將海參性腺凍干并研磨成粉末，過60 目篩。取100 g粉末添加400 mL正己烷和50 mL乙醇（8∶1，V/V），攪拌1 h。4 ℃、8 000×g離心10 min，獲得沉淀后，按上述方法重復操作兩次。將脫脂后的海參性腺粉在室溫下自然風干，置于－20 ℃貯存。

1.3.2 超聲預處理

用蒸餾水將脫脂海參性腺粉（蛋白質量分數約為42.86%）配制成一定質量濃度（1 g/100 mL）的蛋白溶液并置于雙層燒杯中。對溶液進行超聲處理，處理參數：頻率20 kHz；功率200 W[13]；時間0、5、15、25、35 min；間歇模式：超聲2 s和間歇2 s（防止局部過熱。根據預實驗所測水解度得到：未超聲組水解度為7.98%，超聲1 s和間歇3 s組水解度為8.15%，超聲2 s和間歇2 s組水解度為10.11%，超聲3 s和間歇1 s組水解度為9.06%）。超聲處理后，蛋白溶液置于4 ℃保存待進一步處理。

1.3.3 酶解處理

參照Li Haijing等[15]的方法進行酶解處理。用1 mol/L NaOH溶液將超聲預處理后的蛋白質溶液pH值調節至7.0，添加中性蛋白酶（添加量為4 500 U/g）后在50 ℃下進行酶解。酶解終止時，將混合物在100 ℃下煮沸10 min致中性蛋白酶失活。酶解液冷卻至室溫后，于10 000×g下離心30 min。通過雙縮脲法測定上清液的蛋白質量濃度約為10～12 mg/mL。將上清液凍干成粉末，并在－20 ℃下貯存作進一步分析。

1.3.4 側鏈結構的測定

根據Li Haijing等[15]的方法測定海參性腺蛋白酶解物的紫外-可見光譜，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將1.3.3節凍干的粉末配制成0.2 mg/mL的溶液。用紫外-可見分光光度計將樣品溶液在240～360 nm范圍內進行掃描。并以磷酸鹽緩沖液為對照。

1.3.5 二級結構的測定

根據Li Wenwen等[16]的方法使用傅里葉變換紅外光譜測定海參性腺蛋白酶解物的二級結構，并使用Peak Fit Version 4.12軟件對二級結構進行分析，根據酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1）各指定峰的相對面積計算海參性腺蛋白酶解物二級結構相對含量。

1.3.6 三級結構的測定

參考張熙[17]的方法并略作修改，使用熒光分光光度計測定海參性腺蛋白的三級結構。將凍干樣品溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中制備1.0 mg/mL樣品溶液，并在25 ℃條件下進行測定。測定條件：激發波長290 nm、狹縫寬度5 nm、發射波長310～400 nm。

1.3.7 表面疏水性的測定

根據Li Fangfei等[18]的方法測定海參性腺蛋白酶解物的表面疏水性，并略作修改。用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）將海參性腺蛋白酶解物溶液分別稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL。然后，將20 μL ANS（8.0 mmol/L）溶液添加到4 mL海參性腺蛋白溶液中，避光反應10 min。在激發和發射波長分別為390 nm和470 nm的條件下測定。

1.3.8 粒徑分布的測定

參照Li Fangfei等[19]的方法測定酶解物的粒徑分布。將海參性腺蛋白酶解物用蒸餾水配制成1.0 mg/mL蛋白溶液，在室溫條件下用激光粒度儀測定樣品的粒徑分布。

1.3.9 微觀結構的觀察

參照Li Haijing等[15]的方法觀察海參性腺蛋白酶解物的微觀結構。凍干的海參性腺蛋白酶解物涂在雙面導電膠上并在原料涂層上噴金約10 min，用掃描電子顯微鏡在5 000 倍的放大倍數下觀察其形態。

1.4 數據處理與分析

每個實驗重復3 次，每次3 個平行。所得數據使用IBM SPSS Statistics 22.0軟件的Duncan檢驗進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著性。用Origin 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物側鏈結構的影響

蛋白質殘基側鏈基團（如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等）對紫外光有很強的吸收作用，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的紫外吸收峰分別在279、275 nm和257 nm波長處[20]。海參性腺蛋白酶解物側鏈結構的變化可以通過苯丙氨酸在257 nm波長處的紫外-可見光譜反映。如圖1所示，隨著超聲預處理時間的延長（0～15 min），蛋白質的紫外吸光度明顯增加，當超聲時間為15 min時，蛋白質的紫外吸光度增加了7.30%。這可能是因為超聲時間的延長產生了更強的空化作用，破壞了蛋白質分子間的相互作用，導致蛋白質結構的展開和重排，暴露出更多的芳香氨基酸，從而使紫外吸收強度增加[21]。當超聲時間從15 min延長到35 min時，蛋白質的紫外吸光度呈現下降的趨勢，Huang Liuru等[22]也發現超聲處理20 min和30 min后大豆分離蛋白的紫外吸收強度低于超聲10 min后的紫外吸收強度，這可能是因為超聲時間的延長導致一些疏水基團的嵌入或形成更大的聚集體，引起蛋白質表面發色基團數量減少，導致紫外吸光度下降。因此，適當的超聲預處理時間（15 min）有利于海參性腺蛋白酶解物側鏈結構的展開。

圖1 超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物紫外吸收光譜的影響Fig.1 Effect of ultrasound pretreatment on the UV spectrum of sea cucumber gonad protein hydrolysates

2.2 超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物二級結構的影響

傅里葉變換紅外光譜通過基線校正、反卷積、二階導數和吸光度曲線擬合來分析蛋白質二級結構的變化[23]，其中，酰胺I 帶（1 600～1 700 cm－1）能夠反映α-螺旋（1 648～1 664 cm－1）、β-折疊（1 615～1 637 cm－1和1 682～1 700 cm－1）、β-轉角（1 664～1 681 cm－1）和無規卷曲（1 637～1 648 cm－1）的含量[24-25]。不同超聲預處理時間對海參性腺蛋白酶解物二級結構及相對含量的影響如圖2所示，隨著超聲預處理時間的延長，α-螺旋相對含量先降低后升高，在15 min時達到最小值（降低了9.98%），β-折疊相對含量的變化呈現相反的趨勢，在15 min時增加了50.72%。α-螺旋是蛋白質較常見的穩定二級結構，其主要是通過分子內氫鍵來維持蛋白質分子內的有序排列。超聲波空化作用導致蛋白質結構展開，暴露了疏水區域，使分子內氫鍵發生斷裂而減少，從而引起α-螺旋結構含量的減少[15]。β-折疊結構含量的增加可能是因為超聲預處理破壞了維持海參性腺蛋白高級結構的次級鍵（如氫鍵、靜電相互作用和范德華力等），從而引起蛋白結構的展開[26]。然而，過長時間的超聲預處理會中斷分子間的相互作用，引起蛋白質分子聚集，從而使α-螺旋相對含量的升高和β-折疊相對含量的降低[27]。王喜波等[25]指出β-折疊含量還與蛋白質的疏水相互作用有關，其降低表明蛋白質疏水基團暴露，疏水性增強。

圖2 超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物二級結構紅外光譜（A）和相對含量（B）的影響Fig.2 Effect of ultrasound pretreatment on the infrared spectrum (A)and secondary structure composition (B) of sea cucumber gonad protein hydrolysates

超聲預處理顯著降低了海參性腺蛋白酶解物無規卷曲相對含量（P＜0.05），而對β-轉角相對含量影響不顯著（P＞0.05）。這一結果與戴澤川等[28]的結論一致，其同樣發現隨著超聲時間的延長，蝦肌肉蛋白的無規卷曲比例減小。超聲波可以使無規卷曲的聚集結構發生解離，引起其含量下降，從而轉化為β-折疊（0～15 min）或α-螺旋（15～35 min）結構，導致后兩者含量升高[29]。

2.3 超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物三級結構的影響

蛋白的內源熒光光譜可以表征蛋白質中色氨酸殘基的數量，直觀反映蛋白質三級結構的變化情況[30]。如圖3所示，在340 nm波長處附近觀察到所有樣品有一個熒光發射峰，不同超聲預處理時間的海參性腺蛋白酶解物熒光發射峰位置變化不明顯，但熒光強度有明顯變化。樣品的熒光強度隨超聲預處理時間的延長呈現先升高后降低的趨勢，在15 min時有最大熒光強度（比0 min時增加了4.50%）。熒光強度的升高可能是超聲預處理使蛋白質發生伸展，暴露了埋藏在蛋白質內部的色氨酸殘基，引起蛋白質表面的色氨酸殘基含量增加，從而表現出更強的熒光強度[20]。Zou Ye等[31]也認為超聲預處理（20 kHz、100 W、10 min）可以使雞肝水溶性蛋白質結構展開，破壞蛋白質分子的疏水鍵，誘導蛋白質分子內更多疏水基團暴露，從而導致熒光強度增加。隨著超聲時間的繼續延長，熒光強度明顯下降，這可能是過長時間的超聲處理會使蛋白質分子發生交聯、聚集，已經暴露的色氨酸基團重新內包于蛋白質內部，引起蛋白質空間位阻增加，導致熒光猝滅[17]。

圖3 超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物熒光光譜的影響Fig.3 Effect of ultrasound pretreatment on the fluorescence spectrum of sea cucumber gonad protein hydrolysates

2.4 超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物表面疏水性的影響

表面疏水性可以表征蛋白分子表面暴露疏水基團的數量，是評價蛋白質分子構象變化的重要參數[32]。超聲預處理時間對海參性腺蛋白酶解物表面疏水性的影響如圖4所示，隨超聲預處理時間的延長（0～15 min），蛋白表面疏水性呈升高的趨勢，當超聲時間為15 min時，蛋白質的表面疏水性比0 min時增加了13.42%。Jiang Lianzhou等[27]利用超聲（頻率20 kHz、功率300 W、超聲4 s間歇2 s）處理黑豆分離蛋白，結果發現黑豆分離蛋白表面疏水性隨超聲處理時間的延長（12～24 min）而升高。這可能是超聲空化效應能夠使蛋白氫鍵和分子間作用力斷裂，誘導蛋白質結構展開，導致分子內部的疏水基團和區域暴露于周圍的極性環境，使得熒光探針更容易與之結合，從而引起表面疏水性升高[15]。隨著超聲預處理時間的繼續延長（15～35 min），表面疏水性開始降低。這可能是蛋白質在疏水作用的驅動下相互靠近并發生了聚集，導致暴露的疏水基團重新被包埋在蛋白內部[32]。此外，王笑宇等[33]認為超聲波的作用不足以破壞蛋白質分子核心的疏水作用，過度超聲（500 W、15 min）可能會使蛋白質分子結構更加疏松，導致一些親水肽鏈上的基團更容易發生水合作用，使得表面疏水性降低。

圖4 超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物表面疏水性的影響Fig.4 Effect of ultrasound pretreatment on the surface hydrophobicity of sea cucumber gonad protein hydrolysates

2.5 超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物粒徑的影響

d0.1、d0.5和d0.9分別表示粒徑累積分布（0～100%）中10%、50%和90%所對應的粒徑。d3,2為粒徑對表面積加權平均值（表面積平均粒徑），d4,3為粒徑對體積加權平均值（體積平均粒徑），可以用來反映粒徑的變化[34]。粒徑分布和平均粒徑可以反映出蛋白因結構改變發生的聚集行為[18]。超聲預處理時間對海參性腺蛋白酶解物粒徑分布的影響如圖5和表1所示，隨超聲預處理時間的延長，海參性腺蛋白酶解物的體積平均粒徑（d4,3）和表面平均粒徑（d3,2）均先減小后增大，其中超聲預處理時間為15 min時兩者達到最小（36.2 nm和34.3 nm），顯著低于對照組（P＜0.05）。粒徑分布范圍也呈現類似的趨勢。超聲處理使蛋白粒徑減小歸因于超聲空化效應產生的微射流和高剪切應力破壞了蛋白質分子間的相互作用，使蛋白質分解成更小的碎片[15]。田然等[35]認為，超聲空化和聲流的綜合效應還可以增加蛋白質顆粒的碰撞速度和強度，促使大的蛋白聚集體被裂解成更小的碎片，從而引起蛋白質粒徑減小。d0.1、d0.5和d0.9的變化趨勢與d4,3和d3,2的變化趨勢相似，表明適當時間的超聲預處理（15 min）可以減小海參性腺蛋白酶解物的粒徑，防止蛋白質聚集。這可能是因為適當時間超聲預處理產生的機械剪切力使海參性腺蛋白分子被粉碎，導致粒徑變小，而過長時間的超聲作用會導致蛋白質分子重新聚集。此外，齊寶坤等[36]指出，蛋白質的表面疏水性與粒徑之間呈顯著負相關，即蛋白質粒徑越小，其表面疏水性越大，本實驗結果與其所得結論一致。當超聲時間超過15 min時，海參性腺蛋白酶解物的粒徑隨超聲預處理時間的延長而增大，這可能是因為過長時間的超聲處理會產生較強的空化效應，生成過量自由基，從而加速蛋白質分子的運動，使蛋白質分子之間碰撞的機會增加，導致一些蛋白質分子聚集并形成較大的顆粒[37-38]。李笑笑[39]也認為超聲處理使大豆分離蛋白粒徑增大是超聲處理促使部分蛋白質分子相互聯接，并重新聚合所致。

圖5 超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物粒徑分布的影響Fig.5 Effect of ultrasound pretreatment on the particle size distribution of sea cucumber gonad protein hydrolysates

表1 超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物平均粒徑的影響Table 1 Effect of ultrasound pretreatment on the average particle size of sea cucumber gonad protein hydrolysates

2.6 超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物微觀結構的影響

超聲預處理時間對海參性腺蛋白酶解物微觀結構的影響如圖6所示，未經超聲處理的海參性腺蛋白酶解物顯示出許多不規則片段、小孔洞和大聚集體。隨著超聲預處理時間的延長（0～15 min），海參性腺蛋白酶解物組織結構出現了更多的細小孔洞，樣品質地更加疏松，顆粒變小且均勻，這與粒徑分析結果一致。此現象表明超聲空化效應產生的微射流和高剪切應力能夠有效破壞蛋白質緊密結構，使蛋白質組織結構變得疏松多孔，增強了酶與底物的相互作用，從而提高了酶解效率[40-41]。劉運[42]發現馬鈴薯蛋白經過超聲預處理后，其顆粒變得細小，比表面積增大，從而使蛋白與酶有接觸位點數量增加，酶解效率得以提高。隨著超聲預處理時間的繼續延長（25～35 min），海參性腺蛋白酶解物出現了較多大的團聚體，表明過長時間的超聲處理反而使蛋白質發生了聚集，這與熒光和表面疏水性分析結果一致。邸紅艷[43]的研究也表明超聲輔助提取核桃粕蛋白60 min后，原本比較分散的部分蛋白質又重新聚集。

圖6 超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物微觀結構的影響（×5 000）Fig.6 Effect of ultrasound pretreatment on the microstructure of sea cucumber gonad protein hydrolysates (×5 000)

3 討論

海參性腺富含蛋白質、多糖、精氨酸、賴氨酸等營養物質，但在海參的加工過程中，海參性腺通常作為下腳料被丟棄，造成了資源浪費和環境污染[44]。大量研究表明蛋白酶可以促進海參性腺的水解，從而獲得更容易被人體吸收的蛋白水解物[45-47]。然而，常規酶解法存在著時間長和效率低等問題[4]，超聲波作為一種無損、綠色的新興加工技術可以有效提高酶解速率和酶利用率[48]。因此，本研究通過對海參性腺蛋白酶解物側鏈結構、二級結構、三級結構、表面疏水性、粒徑分布和微觀結構進行分析，探究超聲預處理對海參性腺蛋白酶解物結構特性的影響，以期提高海參性腺蛋白的酶解效率。

然而，超聲處理在改善蛋白結構特性方面并不總是具有積極作用。本實驗結果表明：較長時間超聲預處理（25～35 min）的海參性腺酶解物紫外吸收強度、熒光強度和表面疏水性均低于短時間超聲預處理（0～15 min）樣品，這可能是過度的超聲處理導致展開的蛋白質變性，再次發生折疊或聚集，一些疏水基團被包埋于蛋白內部[49]。黃朝湯[50]得到了與本研究不同的結果，即經短時間超聲預處理（0～20 min）的小麥蛋白水解物紫外吸光度和熒光強度均低于長時間超聲預處理（40～80 min）樣品，推測可能是較短時間的超聲處理產生較低強度的空化效應，不足以使蛋白質結構展開，一些疏水基團仍包埋于蛋白質內部[51]。因此，針對不同的實驗原料及研究對象，應確定適宜的超聲預處理參數。

4 結論

不同時間的超聲預處理能不同程度地改變海參性腺蛋白酶解物的結構，隨著超聲預處理時間的延長，海參性腺蛋白質結構先展開后發生聚集。其中，15 min超聲預處理能最大程度地促進海參性腺蛋白結構的展開，暴露出更多的酶解位點和疏水基團。經超聲預處理15 min的蛋白顆粒最小。因此，適當的超聲波預處理（15 min）能夠促進海參性腺蛋白酶解物結構的展開和提高酶解作用，減少聚集體的形成，從而提高海參性腺的利用價值。本研究可為超聲波在海參及其副產品中的應用提供一定的理論依據和技術支持。