抗人類腸道病毒71藥物及疫苗研究進展*

謝小暉，陳路路，李超英，鄭惠丹，張 怡，陶 玲 綜述，徐銀蘭△審校

(1.新鄉醫學院公共衛生學院，河南 新鄉 453003；2.新鄉醫學院外語學院，河南 新鄉 453003)

人類腸道病毒71(EV71)屬腸道微生物群，是微小病毒科，歸屬于人類腸道病毒A。在腸道毒菌群中，EV71是迄今發現最晚的腸道病毒，主要引起5歲以下嬰幼兒神經系統疾病，感染力強且致病率極高[1]。部分患者可出現腦水腫、腦炎、腦脊髓炎、循環衰竭等較為嚴重的腦部疾病。1981年在我國上海發現該病毒，1987年EV71在香港流行，于2008年1月至2019年6月中國疾病預防控制中心建立的手足口病監測系統報告了2 254萬例手足口病病例，導致3 704例患者死亡[2]。

目前，據文獻報道，EV71已有6種基因型，在中國流行的主要是A、B、C型。EV71為二十面體立體結構的單股正鏈RNA病毒，無包膜和突起球形結構，直徑為24～30 nm，基因組大小為7.4 kb。腸道病毒EV71的復制周期包括吸附、進入、脫殼、蛋白翻譯、多聚蛋白加工、基因組RNA復制及病毒組裝和釋放。現將目前EV71的治療與預防研究現狀綜述如下。

1 抗EV71藥物研究進展

1.1抑制病毒復制過程 利巴韋林屬于人工合成的核苷類廣譜抗病毒藥物，作用位點為病毒核糖核酸聚合酶。利巴韋林可對次黃嘌呤脫氫酶產生抑制作用，加速細胞內三磷酸鳥苷庫的消耗，使細胞內能量調控異常，直接對病毒翻譯起始及肽鏈延伸階段產生影響，抑制病毒核酸復制過程，與喜炎平聯用可提高小兒手足口病治愈率，減輕臨床癥狀，降低不良反應發生率[3]。然而利巴韋林的大量使用，導致藥物不良反應發生率上升，臨床表現多種多樣，其中藥物不良反應常見表現有惡心、嘔吐、胸悶和瘙癢，目前已停止使用。瑞德西韋(RDV)是一種腺苷小分子類化合物，發揮抗病毒效果的形式為磷酸化的三磷酸，通過抑制病毒中RNA依賴性的RNA聚合酶活性從而發揮作用[4]。有研究發現，RDV可以識別并與一些病毒的RNA轉錄酶相作用，顯著降低小鼠橫紋肌肉瘤中的病毒載量[5]。藥物發揮作用也能通過阻斷EV71復制過程中的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路來實現，WANG等[6]發現的延胡索堿在一定濃度范圍內可抑制p38-MAPK和c-Jun氨基末端激酶(JNK)-MAPK信號通路，造成環加氧酶2表達量發生變化，進而發揮抗EV71感染的作用。3D蛋白酶又稱為依賴于RNA的RNA聚合酶，是EV71基因組復制的關鍵酶。2′-脫氧-2′-β-氟-4′-疊氮胞苷是一種小核苷類似物抑制劑，通過靶向競爭EV71 3D蛋白酶抑制EV71的復制及RNA的合成，體外抗病毒活性顯著。每2天用1 mg/kg劑量進行1次2′-脫氧-2′-β-氟-4′-疊氮胞苷治療可顯著增強小鼠對EV71的抵抗力，降低小鼠組織中EV71載量，對小鼠起到很好的保護作用[7]。

1.2抑制病毒翻譯過程 EV71的翻譯過程依靠內部核糖體進入位點(IRES)，其是病毒翻譯過程中的關鍵位點，黃酮類化合物山萘酚能抑制病毒依賴的IRES的翻譯過程，降低IRES水平發揮抗病毒作用。作為一種黃病毒抑制劑，腺苷類似物NITD008能阻斷病毒RNA的合成，具有強大的抗EV71作用。NITD008在體外對幾種杯狀病毒表現出低毒性，低濃度即可產生較強的抗病毒活性，該化合物作為治療開發的支架將具有相當大的益處，具有廣泛的應用前景[8]。

1.3抑制EV71多聚蛋白關鍵酶 3C蛋白酶是EV71結構的關鍵酶，首先EV71基因組會翻譯出多聚蛋白，3C蛋白酶需要對合成后的多聚蛋白進一步切割加工，使多聚蛋白成為更小的結構蛋白和非結構蛋白，同時，其還可誘導細胞凋亡并幫助EV71逃避宿主免疫系統的追殺。槲皮素是一種類黃酮化合物，對多種病毒具有抗病毒活性，槲皮素可使EV71 3C蛋白酶活性降低，同時，不影響其他關鍵酶的活性。YAO等[9]研究表明，在橫紋肌肉瘤和Vero細胞中槲皮素會出現低細胞毒性，50%組織細胞感染量大于200 μm，與利巴韋林比較，槲皮素有更好的抗EV71活性和更低的細胞毒性作用。EV71 3C蛋白酶抑制劑——NK-1.8k是近年來研發的抗EV71藥物，EV71 3C蛋白酶結構是一種開放性構象，與其他小RNA病毒的結構有所差異。NK-1.8 k與EV71 3C蛋白酶中的活性位點發生反應，使3C蛋白酶無法發揮其功能，能較好地抑制EV71活性，抗EV71效果顯著[10]。EV71 2A蛋白酶主要參與多蛋白的加工、抑制宿主蛋白合成、逃避先天免疫和誘導細胞死亡等，以目標2A蛋白基因為目標序列合成的小干擾RNA(SiRNA)可專一地作用于2A蛋白酶，進而產生抗EV71的作用。當SiRNA濃度為60 nm時能讓EV71感染細胞達到最高的轉染效率，用SiRNA-2Apro處理后病毒蛋白含量和RNA含量均會明顯低于對照組[11]。

1.4抑制病毒脫衣殼 EV71 VP1蛋白是其關鍵蛋白，具有EV71標志物的作用，抗原識別位點也于此處。普可那利是一種廣譜抗腸道病毒和鼻病毒藥品，作為病毒衣殼結合劑能與VP1蛋白結合，抑制其構象的改變及EV71進入宿主細胞的過程，但存在很大的安全性問題。LI等[12]基于普可那利的母核設計出的DBPR103安全濃度較高。靈芝的活性成分有很多，如有機酸、氨基酸等，其主要活性成分為靈芝三萜。靈芝三萜類化合物可與EV71顆粒相互作用，阻斷EV71的吸附過程，破壞病毒的脫衣殼過程。

1.5抑制病毒的吸附和穿入 兩性霉素B與附著物相作用，抑制EV71在細胞中的內化過程，清道夫受體Ⅱ是EV71的細胞受體，能感染人體細胞，在病毒的早期感染中發揮關鍵作用。JIN等[13]構建的EV71小鼠模型中小鼠腦組織和脊髓在病毒感染后7 d呈現出局灶性變化，神經細胞和膠質細胞的變性增生，炎性反應強烈。ZHANG等[14]構建了一種抗人類清道夫受體2(SCARB2)的單克隆抗體，稱為JL2。JL2單克隆抗體對EV71的感染具有抑制作用，通過3個螺旋α2、α5、α14與人類SCARB2 結合，抑制EV71的吸附與穿入過程。阿卡波糖作為一種潛在的藥物，可有效阻斷EV71從腸道向全身的動態轉移，FENG等[15]研究表明，小腸被證實是EV71感染部位，回腸是EV71在小鼠體內增殖和運輸部位，阿卡波糖通過抑制EV71與細胞表面受體的結合發揮抗EV71作用。

1.6天然化合物 傳統中草藥價格低廉，易于獲得，便于培植，還具有廣譜抗病毒優點。很多中藥單體均是天然化合物，抗EV71作用較好。使用中草藥發揮抗病毒的效果將會是一個廣泛的應用前景。開發和研究傳統中草藥抗EV71作用具有重要的臨床實用意義。

1.6.1姜黃素 姜黃素是姜黃的主要活性成分，具有許多方面的作用，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等，還擁有較為廣泛的抗病毒活性。姜黃素廣泛使用在臨床中醫藥治療中，由于具有抗氧化等特性，在抗感染、抗腫瘤、抗病毒感染中發揮作用[16]。姜黃素具有顯著的抗病毒效應，可抑制豬圓環病毒2型(PCV2)誘導的線粒體凋亡，降低細胞凋亡率，緩解PCV2誘導的線粒體凋亡[17]。姜黃素不調節EV71的吸附與內化過程，僅可以對EV71的復制具有抑制作用，與α干擾素(IFN-α)聯用可顯著增強IFN-α的抗EV71活性。有研究發現，EV71會降低SH-SY5Y細胞中I型干擾素受體水平，姜黃素通過抑制SH-SY5Y細胞中干擾素受體水平的降低增強IFN-α的抗EV71活性[18]。

1.6.2苦參堿 苦參始于神農本草經，含有多種化學成分，其主要成分為苦參堿和氧化苦參堿。在傳統醫學的觀點中苦參具有多種藥理學作用，如清熱燥濕、利尿、殺蟲等作用，現代研究表明，苦參除以上作用外，還可改善心律失常，以及抗病毒、抗瘤等作用[19]。苦參堿對EV71具有預防作用，安全范圍較好，較低濃度可預防EV71感染，并且能對EV71的活性有很好的抑制作用。XU等[20]研究表明，苦參堿與蛇床子素聯合使用可通過降低PCV2降解物激活蛋白的表達共同抑制PCV2導致的細胞凋亡。

1.6.3莪術醇 莪術醇是從莪術根中提取的一種天然化合物，莪術醇具有多種生物學活性，已用于治療心肌炎，且可用于抑制腦心肌炎病毒活性。有研究發現，與利巴韋林陽性對照組比較，莪術醇抑制率明顯高于利巴韋林，安全濃度較高。莪術醇可增加T淋巴細胞內IFN-β蛋白的表達，從而對腦心肌炎病毒的活性產生抑制作用[21]。

1.6.4黃芩苷 黃芩苷是黃芩的主要活性成分之一，具有優秀的抗炎作用，還可調整線粒體誘導的細胞凋亡途徑，使活化的T、B淋巴細胞加速凋亡。黃芩苷對腦心肌炎病毒的最大抑制率高于利巴韋林，同時，選擇性指數低于陽性對照組，說明黃芩苷具有良好的抗病毒活性[22]。

1.6.5片仔癀 片仔癀具有顯著的抗病毒、抗腫瘤作用，在抗EV71體外感染過程中可有效抑制多種EV71毒株的活性，抑制病毒綠色熒光蛋白質的表達，降低EV71的感染能力[23]。在病毒吸附前使用槐啶堿可增加細胞對EV71的抵抗力。

1.6.6金銀花 喂食金銀花提取物或接種micoRNA-let-7a的EV71感染的吸吮小鼠，表現出臨床評分降低和存活時間延長等特點，伴有病毒RNA、蛋白表達和病毒滴度降低[24]，表明金銀花水提取物可抑制EV71在體內、外的復制。

1.7抗氧化物 氧化應激可增強病毒復制能力，EV71感染會誘導宿主細胞氧化應激能力的提升，從而增強病毒的侵襲能力，故抑制機體氧化應激可抑制EV71的感染。

1.7.1薄荷 薄荷可清熱解毒，同時，具有藥理作用廣、毒性低、成本低廉等優點，因此，薄荷的應用價值是多種多樣的。薄荷的成分眾多復雜，具有抗氧化作用，其普列薄荷成分具有廣泛的抗癌作用[25]。

1.7.2靈芝類 近年來，以二氧化碳超臨界萃取法制備的靈芝孢子油作為一種新型產品而出現，具有抗腦缺血再灌注損傷和抗氧化、清除自由基等功效，作為靈芝主要活性成分的靈芝三萜是從靈芝菌絲中產生的代謝產物，具有抗病毒、抗癌活性。

1.7.3蘆丁 蘆丁是一種類黃酮類化合物，廣泛分布于各種常見物質中，如水果、蔬菜等，具有一系列廣泛的作用，如抗氧化、抗病毒、抗癌等[26]。蘆丁衍生物的藥理活性很多，MECENAS等[27]合成的蘆丁乙酸酯具有很好的抗氧化性，可降低感染細胞的氧化應激能力和活性氧含量，且對哺乳動物無毒。

1.7.4漆黃素 漆黃素是一種較常見的類黃酮多酚物質，廣泛分布于水果、黃櫨、蔬菜和漆樹中。漆黃素分子結構中存在自由的羥基和羰基具有良好的抗氧化作用，可通過多酚氧化酶發揮自由基清除作用，也可抑制活性氧生成，保護細胞[28]。

1.8細胞因子 腫瘤壞死因子-α是一種功能強大的細胞因子，在免疫活動中具有強大的適應性，促炎細胞因子——腫瘤壞死因子-β參與了多種炎癥、抗病毒和免疫刺激反應。白細胞介素-4由先天淋巴細胞如自然殺傷T細胞和髓樣細胞(如嗜堿性粒細胞和肥大細胞)產生，是2型免疫反應的標志性細胞因子，也具有非免疫功能[29]。

2 疫苗研究進展

防控EV71最有效的措施還是注射疫苗，抗EV71的疫苗主要包括以下幾種。

2.1減毒活疫苗 減毒活疫苗是將完整病原體進行活疫苗的減毒，可誘導細胞免疫及體液免疫，給機體帶來更長久的保護，但存在多種安全性問題。

2.2滅活疫苗 滅活疫苗是將病原體滅活得到的疫苗，相比于減毒活疫苗，不良反應較小，產生抗體的能力強，有效性和安全性較好。2015年我國成功研制出EV71全病毒滅活疫苗，并于2016年開始投入使用[30]，在后期的臨床調查中發現，被觀察者體內干擾素、白細胞介素、免疫球蛋白G等水平均得到上調，疫苗的保護周期長、安全性高、免疫原性強[31]。FAN等[32]研發的二價滅活EV71/柯薩奇病毒A16型(CA16)疫苗可使小鼠體內免疫相關趨化因子表達上調，可提高小鼠對EV71、CA16感染的有效免疫力。

2.3病毒樣顆粒(VLP)疫苗 YANG等[33]在畢赤酵母中制備了EV71 VLP疫苗，當EV71 VLP為每劑1～5 μg、佐劑為每劑225 μg時可引發強大的保護性中和抗體反應，并針對小鼠提供強有力免疫屏障。WANG等[34]發現，接種在皮基亞牧羊犬中產生的重組EV71樣顆粒疫苗小鼠的免疫血清也表現出對EV71異源亞型的交叉中和活性。LUO等[35]制備的EV71 VLP及其嵌合體疫苗可誘導機體產生較強的免疫應答，保護小鼠抵抗致死性EV71、CA16感染。

3 小 結

預防EV71感染，疫苗防控仍是目前的主流手段，但安全性問題較多，保護效果不佳，存在毒力恢復等安全性問題，且大多數疫苗均是針對的EV71 C4亞型，加之目前尚無特效藥品治療EV71感染，現在使用的藥物多少均存在著一些不良反應，有些藥物還容易引起病毒的耐藥性，開發新的、不良反應少的抗EV71藥物迫在眉睫。傳統中草藥具有價格低廉、易于獲得、便于培植、廣譜抗病毒等許多優點。天然化合物的聯合使用可減少病毒耐藥性的產生，還可減少藥物用量，可能成為新的抗EV71的研究方向。