糖腎方通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)自噬減少非酒精性脂肪性肝病小鼠肝臟脂質(zhì)沉積

楊景舒，楊 猛，李 平，趙海玲，孫秋月，武曦藹，楊 鑫，張 韞，龔文心，程思益，李 忻*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 普外乳甲外科，北京 100029；3.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029；4.中日友好醫(yī)院 內(nèi)分泌科二病區(qū)，北京 100029）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指排除過量飲酒史而出現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂和脂肪蓄積，常伴有肥胖、糖尿病、高脂血癥、高血壓等代謝異常[1]。研究顯示，全球NAFLD 患者占總?cè)丝诘?2.4%，且呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢[2]。目前，NAFLD 的病因尚不明確，臨床上沒有標(biāo)準(zhǔn)的治療藥物，流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果認(rèn)為其可能與遺傳、飲食結(jié)構(gòu)、運動缺乏和菌群失調(diào)等因素有關(guān)[3]。自噬是一種自我降解過程，通過消除多余的細(xì)胞器或大分子物質(zhì)來維持細(xì)胞和生物體穩(wěn)態(tài)。自噬的功能異常與糖尿病、肥胖、NAFLD、高脂血癥等多種代謝疾病相關(guān)[4]。研究表明，自噬障礙能夠引起肝臟脂質(zhì)沉積，導(dǎo)致NAFLD 發(fā)生[5]。鑒于自噬在NAFLD 中的關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)自噬可能是治療NAFLD的潛在策略。

糖腎方顆粒劑（Tangshen Formula，TSF）由黃芪、生地黃、山茱萸、枳殼、鬼箭羽、三七和熟大黃按照一定比例配制而成，具有益氣柔肝、活血通絡(luò)之功效。臨床研究發(fā)現(xiàn)，TSF 可提高糖尿病患者血清高密度脂蛋白、降低血清低密度脂蛋白及甘油三酯水平[6]。前期研究觀察到TSF 可以顯著減少2型糖尿病小鼠肝臟中的脂質(zhì)堆積，對血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）等標(biāo)志物進行調(diào)控，同時還能調(diào)整調(diào)節(jié)甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）的代謝失調(diào)[7]，但其具體分子機制還需進一步探討。基于此，我們使用NAFLD 小鼠模型來研究TSF對NAFLD的治療效果和可能的機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠24 只，8 周齡，購自北京華阜康實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所實驗動物平臺，實驗動物許可證號：SYXK（京）2023-0001，濕度（55±15%）和溫度（23±3°C）環(huán)境，所有實驗及操作遵循《實驗動物管理條例》進行。本實驗通過中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所實驗動物倫理審批，批號：zryhyy21-21-01-15。

1.2 藥物與試劑

TSF 顆粒購自北京亞東制藥有限公司。蘇木素-伊紅（HE）以及油紅O 染色試劑購自索萊寶生物科技有限公司。LC3B 抗體購自美國Sigma 公司，p62 抗體購于日本MBL 公司，SIRT1、mTOR 和p-mTOR 的抗體購自美國Santa Cruz 公司和Cell Signaling Technology公司。

2 方法

2.1 實驗分組及糖腎方（TSF）干預(yù)

選取健康SPF 級8 周齡C57BL/6J 小鼠24 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機分為4 組（每組6 只）：對照組（ND）、對照+TSF 組（ND+TSF）、模型組（HFD）、模型+TSF 組（HFD+TSF）。對照組和對照+TSF 組小鼠給予正常飲食（normal diet，ND），模型組和模型+TSF 組小鼠給予高脂飲食（high fat diet，HFD）。各組小鼠均自由獲得飲用水及食物。造模4周后對ND+TSF組、HFD+TSF組小鼠進行TSF（2.4g/kg/d）灌胃，治療12周。實驗結(jié)束前，所有小鼠被禁食12h后處置，采集血清和肝臟組織。

2.2 肝組織病理學(xué)檢測

HE 染色：小鼠肝臟右葉浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24h。隨后，將組織包埋在石蠟中，并進一步切割成厚度約為5μm 的薄片。用HE 進行染色處理。染色完成后的切片經(jīng)過脫水和封閉步驟后在顯微鏡下觀察。

油紅O染色：將冷凍包埋的肝臟組織冰凍切片干燥處理后，切片用油紅O 浸染20min，使用60%的異丙醇溶液分化，再用蘇木素染色小鼠肝臟組織中的細(xì)胞核1min 并進行返藍處理。染色完成后，用甘油封閉切片，并在顯微鏡下進行觀察。

2.3 血清生化指標(biāo)檢測

各組小鼠采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后眼球取血，離心分離血清，全自動生化分析儀測定小鼠血清ALT、AST、TC和TG的表達水平。

2.4 Western Blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達

采用免疫印跡法（Western blot）檢測自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B-Ⅰ/Ⅱ、自噬底物p62、沉默信息調(diào)節(jié)因子（silent information regulator 1，SIRT1）及自噬上游關(guān)鍵分子mTOR 等的表達。每個樣本肝組織稱取50mg，并采用RIPA 裂解液對其進行完全裂解。完成后，對樣本進行離心后取上清液，進一步使用BCA 方法評估其蛋白含量。隨后，采用6%～12.5%的SDS-PAGE 凝膠對蛋白進行電泳分離，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%脫脂奶粉對PVDF膜室溫封閉2h，在常溫下分別加入β-actin（1∶3000）、LC3B（1∶2000）、P62（1∶2000）、SIRT1（1∶1000）、p-mTOR（1∶1000）和mTOR（1∶1000）抗體孵育2h。放置搖床上使用TBST 洗滌后，加入二抗IgG 抗體（1∶3000），在常溫下孵育1.5h。TBST洗滌后，用ECL 試劑進行顯影，并通過Bio-Rad 設(shè)備獲取圖像。最后，采用ImageJ 軟件分析條帶的灰度值，以β-actin 作為參照標(biāo)準(zhǔn)，目標(biāo)蛋白表達以相對灰度表示。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

本實驗所得數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.3 軟件進行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，多組間比較用One-way ANOVA 檢驗分析，方差分析有統(tǒng)計學(xué)意義時采用Tukey 法進行兩兩比較。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 糖腎方（TSF）對NAFLD 小鼠血清ALT、AST、 TC和TG水平的影響

與正常飼料喂養(yǎng)的ND 組小鼠相比，高脂飼料喂養(yǎng)的HFD 組小鼠血清中的ALT、AST、TC 和TG 水平明顯升高，（P<0.05，P<0.01）；與HFD 組比較，HFD+TSF 組的ALT、AST、TC 和TG 水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），見表1。

表1 TSF對NAFLD小鼠血生化水平的影響（n=6，±s）

表1 TSF對NAFLD小鼠血生化水平的影響（n=6，±s）

注：與ND 組比較，# P<0.05，## P<0.01；HFD+TSF 組與HFD 組比較，* P<0.05，** P<0.01

TC（mmol/L）2.36±0.22 2.32±0.84 4.31±0.79##3.03±1.02*TG（mmol/L）0.68±0.11 0.64±0.23 1.30±0.25##0.89±0.18**組別ND ND+TSF HFD HFD+TSF ALT（IU/L）50.33±6.62 48.17±11.02 152.83±34.95##107.33±22.62##**AST（IU/L）129.67±24.01 126.17±27.67 179.67±27.29#135.83±22.12*

3.2 糖腎方（TSF）對NAFLD 小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

HE染色顯示，ND 組中的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，從中央靜脈開始向外輻射，整齊有序地排列，肝小葉的形態(tài)清晰。而HFD 組的小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)損壞、界限模糊，且肝細(xì)胞變得腫大，出現(xiàn)脂肪空泡以及炎癥細(xì)胞滲透和部分肝細(xì)胞壞死。HFD+TSF 組的小鼠肝細(xì)胞形態(tài)相對于HFD 組有明顯改善，其病理損傷較輕，脂肪空泡數(shù)量和大小都顯著減少。見圖1（封三）。

圖1 各組小鼠肝組織病理形態(tài)變化 （×400）

在油紅O 染色中，ND 組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)呈淡藍色，基本沒有橙紅色的脂滴；HFD組肝組織中廣泛分布有大量、體積較大的橙紅色脂滴，其中部分脂滴甚至融合成片狀，說明肝組織中有嚴(yán)重的脂質(zhì)沉積；相較于HFD 組，HFD+TSF組的肝臟脂質(zhì)沉積明顯減輕，見圖1（封三）。

3.3 糖腎方（TSF）對NAFLD 小鼠肝組織自噬相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與ND 組相比，HFD組肝臟SIRT1、LC3B-Ⅱ蛋白表達水平明顯下降（P<0.01），p-mTOR、p62 蛋白表達水平明顯上調(diào)（P<0.01）；經(jīng)過TSF處理后，與HFD組相比，HFD+TSF 組小鼠肝臟p-mTOR/mTOR 蛋白表達水平比值和SIRT1、LC3B-Ⅱ、p62 蛋白表達水平得到恢復(fù)（P<0.05，P<0.01），見表2、圖2。

表2 TSF對自噬相關(guān)蛋白表達的影響 （n=6，±s）

表2 TSF對自噬相關(guān)蛋白表達的影響 （n=6，±s）

注：HFD 組與ND 組比較，## P<0.01；HFD+TSF 組與HFD 組比較，* P<0.05，** P<0.01

LC3B-Ⅱ（%）1.56±0.05 1.53±0.15 0.56±0.03##1.31±0.25**P62（%）0.44±0.1 0.46±0.04 0.82±0.06##0.58±0.08*SIRT1（%）0.68±0.05 0.53±0.11 0.21±0.06##0.39±0.03*p-mTOR/mTOR（%）0.51±0.04 0.51±0.11 1.19±0.15##0.81±0.14*組別ND ND+TSF HFD HFD+TSF

圖2 TSF對自噬相關(guān)蛋白表達影響的Western blot結(jié)果

4 討論

NAFLD 是一種復(fù)雜的慢性肝病，常與肥胖、糖尿病和高脂血癥等疾病密切相關(guān)，其發(fā)病率逐年增加。對于NAFLD，西醫(yī)尚無有效的藥物治療，治療多為干預(yù)生活方式及調(diào)節(jié)代謝水平，但治療效果不佳，因此尋找有效的治療手段日益迫切。中醫(yī)學(xué)并無NAFLD 這一病名，根據(jù)NAFLD 的臨床表現(xiàn)可將此病歸屬“肝癖”“肋痛”“肥胖”等病癥范疇[8]。此類疾病常因飲食不節(jié)，勞逸失常等誘發(fā)，病機總屬本虛標(biāo)實，以臟腑功能失調(diào)為本，痰濕瘀為標(biāo)，氣機運行不暢，脂肪積聚于肝臟，進而形成脂質(zhì)沉積[9]。治療NAFLD 可使用益氣柔肝，活血通絡(luò)的方法[10]。TSF 以黃芪為君，補氣升陽，利水消腫；生地清熱涼血，三七與鬼箭羽活血化瘀，逐血通經(jīng)，大黃清熱瀉火，涼血解毒，四藥為臣，與黃芪共奏陰陽調(diào)劑，補而不行滯；山萸肉、枳殼為佐藥，二者收斂固澀，理氣行滯，共同調(diào)暢氣機[11]。方中三補四瀉，起到扶正祛邪，攻補兼用的功效，既補氣陰之不足又祛瘀濁之有余，達到益氣柔肝、活血通絡(luò)之效[12]。在本次實驗中，我們使用高脂飲食喂養(yǎng)的方法構(gòu)建NAFLD 小鼠模型。模型組小鼠血清中ALT、AST、TC 和TG 的水平明顯提高，其肝臟組織出現(xiàn)炎性浸潤、脂肪變性和脂質(zhì)沉積等病理變化，這些指標(biāo)均提示模型建立成功。實驗數(shù)據(jù)進一步顯示，糖腎方（TSF）能有效降低NAFLD 小鼠的血生化指標(biāo)，并減輕其肝臟中的脂肪積累，證實具有益氣柔肝、活血通絡(luò)作用的TSF對NAFLD模型小鼠療效顯著。

盡管已有大量研究關(guān)注NAFLD 的發(fā)病原因，但其確切的發(fā)病機制尚不完全清楚[13]。近年來，自噬在NAFLD 的發(fā)病機制中的作用受到了廣泛關(guān)注。自噬是溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)降解途徑，在維持肝臟代謝穩(wěn)定方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14]。mTOR 為自噬的負(fù)調(diào)節(jié)劑，通過影響自噬體的形成來抑制自噬的發(fā)生[4]，在細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)下，mTOR 活化被抑制，促進細(xì)胞自噬，以回收再利用細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)[15]。SIRT1 是去乙酰化酶的一種，能夠直接脫酸化自噬相關(guān)蛋白，如Atg5，Atg7和Atg8，進而促進自噬體的形成。SIRT1 通過抑制mTOR 信號途徑來增強自噬。mTOR 是一個抑制自噬的關(guān)鍵蛋白，SIRT1 通過抑制其活性從而促進自噬的啟動[16]。位于細(xì)胞核中的LC3B-Ⅰ被SIRT1 脫乙酰化，去乙酰化的LC3B-Ⅰ輸出到細(xì)胞質(zhì)中被轉(zhuǎn)化為LC3B-Ⅱ，LC3B-Ⅱ是自噬膜形成的標(biāo)志[17]。p62 是與LC3B-Ⅱ結(jié)合后被降解的產(chǎn)物，當(dāng)自噬體與溶酶體之間的融合受到抑制時，會觀察到p62 的積累[18]。既往研究表明，NAFLD患者和動物模型研究證實了自噬障礙與肝臟脂質(zhì)沉積密切相關(guān)[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAFLD 小鼠肝臟組織中，SIRT1、LC3B-Ⅱ蛋白表達水平明顯下降，p-mTOR、p62 水平顯著升高。TSF 干預(yù)后，各蛋白表達水平均明顯恢復(fù)，提示TSF 可能通過增強自噬改善肝細(xì)胞脂肪累積及肝臟破壞程度。

本研究表明TSF 可通過調(diào)節(jié)自噬來減少NAFLD 小鼠的肝臟脂肪積累，改善肝功能異常。盡管如此，TSF 調(diào)控自噬改善NAFLD 的確切機制尚待進一步研究，其發(fā)揮主要治療作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還尚不明確，需要進行更系統(tǒng)的研究，揭示其療效機制，為TSF的臨床應(yīng)用提供研究依據(jù)。