Eph受體相互作用蛋白B2-肝細胞激酶B4信號通路在正畸牙移動壓力側牙周改建中的作用

鄧旭霞，呂 翔，徐巍巍，劉雅飛

(河北中石油中心醫院口腔科，河北 廊坊 065000)

正畸牙移動(orthodontic tooth movement，OTM)的重塑主要發生在牙周韌帶區域附近[1]。已經發現壓迫會使牙周韌帶區域變窄并導致缺氧微環境，從而增強破骨細胞生成[2]。目前，在OTM期間，仍然存在許多正畸治療挑戰；例如，正畸力過度、不適當的力方向和治療時間延長都可能導致醫源性牙周組織損傷[3]。由于機械負荷在OTM期間牙周韌帶和牙槽骨重塑中起著至關重要的作用，因此了解牙周組織在機械力下的生理反應并闡明潛在的分子機制可能具有重要的臨床意義[4]。最近報道了Eph受體相互作用蛋白B2(Eph receptor interaction proteins B2，Ephrins B2)-肝細胞激酶B4(Erythropoietin-producing hepatocyte kinases B4，EphB4)信號在牙周組織中的表達，存在于各種細胞類型中，包括牙周膜成纖維細胞、成骨細胞和破骨細胞[5]。同時，EphrinB2和EphB4的表達可能受到機械應力的調節，進一步提示了它們在正畸力誘導的牙齒移動過程中可能具有調節作用。考慮到OTM也是機械應力下成骨和破骨細胞生成的耦合過程，本研究旨在探討EphrinB2-EphB4信號在OTM過程中是否參與牙槽骨重塑。首先，我們在大鼠模型中探索OTM期間壓力側EphrinB2-EphB4信號的變化。然后，通過局部抑制EphB4活性驗證了EphrinB2-EphB4信號在牙槽骨重塑中的重要調節功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物本研究于2021年10月至2022年1月，從上海實驗動物研究中心獲得60只6周大的雄性Wistar大鼠，體重(200±10) g，飼養于本院實驗動物中心。適應2天后，參照文獻方法建立OTM動物模型[5]。使用固定在左上頜第一磨牙和門牙之間的3M Unitek鎳鈦螺旋彈簧(美國CA公司)產生100 g的力來誘導牙齒移動。插入后立即激活設備，每天檢查彈簧。在實驗期間沒有進行重新激活。為了考察在OTM過程中EphrinB2-EphB4信號在壓力側表達情況，將24只大鼠分為應用正畸螺旋彈簧的前一天(第0天)和OTM牙齒移動后3、7、14天組，每組6只。在規定的時間處死大鼠，采集包括第一磨牙在內的左上頜骨塊用于免疫印跡分析以及免疫組織化學分析。然后將其余36只大鼠分為對照組、OTM組和EphB4抑制劑(NVP-BHG712)組，每組12只。對照組應用相同未激活的正畸矯治器。OTM組和NVP-BHG712組建立OTM模型。NVP-BHG712組從應用正畸螺旋彈簧的第1天開始在左上頜第一磨牙附近牙周組織的頰舌側皮下注射NVP-BHG712(美國APExBIO公司)，劑量為20 μl，濃度為4 μmol，連續治療14天；對照組和OTM組只接受載體(0.1%乙酸)。在第14天處死所有大鼠，并收獲包括左上頜第一磨牙的牙槽骨塊、上頜骨和牙周組織用于微型計算機斷層掃描(Micro-CT)分析和組織學分析。

1.2 方法

1.2.1測量牙齒移動的距離 牽引14天后，使用inspeXio SMX-100CT微焦點X射線系統(日本SHIMADZU公司)進行微CT成像。成像條件為管電壓75 kV，管電流140 μA，閾值設置為212～1000。使用3DBon(日本Ratoc System Engineering Corporation公司)測量牙齒移動的距離。該距離定義為活動牙釉質最遠點與第二磨牙最近中點之間的直線距離。同時，記錄骨體積/組織體積比值、骨密度、骨小梁數、骨小梁厚度和骨小梁間隙。

1.2.2組織學分析 取出上頜骨并在4 ℃ 4%中性緩沖福爾馬林中固定48 h。樣品在10% EDTA溶液(pH 7.4)中脫礦4周。脫礦質標本在流水下沖洗，按常規方法制備石蠟包埋塊，從磨牙制備約6 μm厚的橫切面，進行蘇木精和伊紅(H&E)染色和使用市售試劑盒(VECTASTAIN ABC-AP Kit(美國Vector Laboratories公司)進行免疫染色，檢測EphrinB2和EphB4蛋白的表達。切片脫蠟，室溫下用含有0.3% Triton X-100的PBS處理20 min，然后浸入3%過氧化氫中以阻斷內源性過氧化物酶活性。2%正常山羊血清處理切片30 min，與一抗在PBS中室溫孵育1 h。與辣根過氧化物酶綴合的抗兔IgG抗體在室溫下孵育30 min并通過DAB顯色。使用Image-Pro 6.1軟件對染色進行量化。

1.2.3蛋白質印跡分析 將獲得的組織在液氮環境中徹底研磨，并在4 ℃下用RIPA裂解30 min。 收獲組織并在4 ℃和12000 rpm下離心30 min。每組取20 μg蛋白質在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離并轉移到聚偏二氟乙烯膜(美國Millipore公司)上。用含有0.1% Tween-20和5%脫脂牛奶的Trisbuffered緩沖液封閉膜，然后在4 ℃下與EphrinB2 (1∶1000)、EphB4 (1∶1000)和GAPDH (1∶20000)孵育過夜。將膜用TBST洗滌3次，并與山羊抗鼠或抗兔HRP偶聯的二抗(1∶20000)在室溫下孵育1 h。TBST洗滌3次后，用化學發光系統檢測條帶。使用Image-Pro 6.1軟件對暴露的蛋白質條帶進行量化。

1.2.4實時定量聚合酶鏈反應(qPCR) 取出第一磨牙，剝除周圍組織進行研磨并儲存在液氮中。使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA。通過測量260/280比率來檢測總RNA的質量，并在260 nm處記錄吸光率。然后使用轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒(日本Takara公司)將RNA逆轉錄為cDNA。反應條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃加熱5 s，最后冷卻至4 ℃。使用SYBR Green PCR Master Mix和LightCycler 96 Instrument (上海Roche公司)檢測mRNA表達。采用GAPDH作為管家基因。引物序列見表1。

表1 本研究中使用的引物序列

1.3 統計學方法采用GraphPad Prism(8.0版)軟件進行數據分析。計量數據表示為均數±標準差，應用方差分析進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OTM過程中EphrinB2-EphB4信號在壓力側表達情況與第0 d比較，在OTM第4、 7、 14 d時EphrinB2和EphB4蛋白表達增加，在第7 d時達到峰值，并在第14 d略有下降。見圖1。

圖1 免疫印跡檢測OTM過程中EphrinB2-EphB4蛋白在壓力側表達情況

2.2 EphB4抑制OTM并增加骨密度與OTM組(301.43±44.64) μm比較，NVP-BHG712組第一磨牙和第二磨牙的距離(164.08±30.79) μm顯著降低(P<0.05)。見圖2。與對照組比較，OTM組骨體積/組織體積比值、骨密度、骨小梁數、骨小梁間隙均顯著降低，骨小梁厚度顯著增加(P<0.05)。NVP-BHG712組的骨體積/組織體積比值、骨密度、骨小梁數、骨小梁間隙較OTM組顯著增加，骨小梁厚度顯著降低(P<0.05)。見表2。

圖2 各組大鼠在OTM第14天后第一和第二磨牙的顯微CT圖像(n=6) M1：第一磨牙；M2：第二磨牙

表2 骨微結構的定量評估(n=6)

2.3 EphB4抑制影響OTM期間牙周韌帶的形態HE染色可見對照組第一磨牙牙周形態規則，細胞排列有序，而OTM組牙周形態不規則，空泡結構大，細胞排列無序。與OTM組比較，NVP-BHG712組牙周膜形態較對照組紊亂，但空泡較OTM組少，提示EphrinB2-EphB4信號抑制可影響牙周膜形態。見圖3。

圖3 上頜第一磨牙根三叉區牙周膜鏡下表現 a:對照組；b:OTM組；c:NVP-BHG712組(HE染色，×40) PDL：牙周韌帶；AB：牙槽骨

2.4 EphB4抑制影響牙周組織中的炎癥相關基因與對照組比較，OTM組第一磨牙牙周組織中IL-1、IL-6和TNF-α的表達均顯著增加(P<0.05)。與OTM組比較，NVP-BHG712組IL-1、IL-6和TNF-α的表達均顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 OTM過程中各組牙周組織炎癥相關基因IL-1、IL-6和TNF-α的mRNA表達比較(n=6)

3 討論

Ephrin-Eph信號通過改變細胞骨架參與介導細胞遷移和細胞粘附[6]。最近，越來越多的研究報道了EphrinB2-EphB4信號在調節骨穩態中的作用[7，8]。OTM與牙槽骨的重塑相結合，表明該過程也參與了機械負荷下骨穩態的調節。在牙齒運動的壓力側，骨形成活動在機械負荷下占主導地位，這與EphrinB2-EphB4信號在骨穩態中的作用是一致的。因此，本研究探討了EphrinB2-EphB4信號在機械力誘導OTM中的作用。機械力過小不能達到牙齒移動的效果，力過大會引起牙根吸收，牙槽骨吸收過多，從而產生諸多副作用。因此，選擇合適的力模型是OTM模型成功的關鍵因素之一。一項研究表明，100 g的力可以促進破骨細胞募集，正畸牙齒移動，并且沒有牙根吸收，表明100 g的力是大鼠OTM模型中最理想的力[5]。因此，本研究對大鼠施加100 g的力，建立OTM模型，模擬最佳臨床生理OTM。我們發現對照組在正畸力施加過程中EphB4的表達上調。EphB4的表達在牙齒移動7天后達到峰值，在第14天僅略有下降。同樣，EphrinB2的表達在實驗過程中表達與EphB4的變化趨勢一致。結果表明，牙周組織中EphrinB2-EphB4信號的表達在壓力作用下升高。我們推測EphrinB2-EphB4信號的激活可能有助于OTM期間的牙槽骨重塑。

既往研究在大鼠體內建立了相同的OTM模型，將注射EphB4抑制劑NVP-BHG712注射到大鼠牙周局部，可以有效抑制牙周膜的EphB4信號水平[9]。因此，本研究遵循之前的藥物應用，并選擇了解剖學上是明確定義的三叉區來檢測骨密度[10]，結果顯示OTM會引起牙周膜結構的改變和根部三叉處細胞排列的紊亂。EphB4抑制后，牙周膜排列整齊，空泡明顯減少，炎癥細胞減少，提示EphrinB2-EphB4信號可能影響OTM牙周膜形態。

研究表明，炎癥是宿主對組織損傷的局部反應，是對微生物物質入侵以及化學和物理刺激的反應[11～13]。在OTM的生理過程中，炎癥反應很明顯。牙周韌帶受壓后，局部血流減少，白細胞遷移到血管外空間，炎癥反應擴散到更廣泛的組織區域，并被多種內源性化學介質放大[14]。血管和細胞的炎癥變化是由正畸牙齒的牙周組織中檢測到的許多生化物質介導和維持的，以刺激或抑制自分泌或抑制細胞活動。已知IL-1、IL-6和TNF-α是促炎細胞因子，可誘導各種蛋白質的合成，從而引起急性或慢性炎癥[14～16]。此外，它們還參與了OTM的過程[17]。本研究結果表明，OTM后IL-1、IL-6和TNF-α的表達增加，其他研究也證明大鼠和小鼠OTM后牙周組織IL-1、IL-6和TNF-α的表達增加[18]，而EphB4抑制后炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-α的表達減少。這可能是因為EphrinB2-EphB4信號可以調節牙周相關疾病的發作，干擾繼發性免疫和炎癥，并調節其他類型的細胞死亡[19，20]。

總之，本研究證明了牙周膜的EphB4抑制減少了骨密度的下降，抑制了炎癥因子的表達，使牙周膜在OTM過程中有序排列，為開展有效的臨床正畸治療和調控炎癥提供了有益的途徑，進而實現更高效、更健康的牙齒移動。然而，EphrinB2-EphB4信號影響炎癥的具體機制有待進一步探索。