黃精組織培養與快速繁殖技術研究

鄧少華，劉娟娟，陳丹鳳，崔 強,2，肖穩運，張海霞,2

(1.郴州市林業科學研究所，湖南 郴州 423000；2.郴州市林下經濟植物資源培育與利用技術研發中心，湖南 郴州 423000)

1 引言

黃精(Polygonatumcyrtonema) 又名“姜形黃精”，為百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)多年生草本植物。自然分布于河南、安徽、浙江、江西、湖南和貴州等省，多生長于林下、灌叢或山坡陰處。黃精根莖既供藥用，又可食用，以其干燥根莖入藥[1～3]。現代研究表明，黃精富含多糖、皂苷、黃酮等化學成分[4～6]。黃精是傳統藥食兩用的補益類藥材，隨著市場需求日益增長，野生資源過度采挖，加之生態環境的破壞，導致其野生資源日益枯竭，人工種植是解決其資源匱乏的重要途徑之一[7]，而當前黃精繁殖方法主要有種子繁殖 (有性繁殖) 和根狀莖分株繁殖 (無性繁殖)，種子繁殖存在收集難度大、發芽率低、育苗周期長和后代性狀分化嚴重等問題[8]；根狀莖繁殖存在繁殖率低和易積累病毒等缺點[9]，因此黃精的組培快繁研究極具意義，既豐富了繁殖方式，又滿足了種苗供應。劉紅美等[10]與李鶯等[11]通過系統試驗, 初步建立了黃精組培快繁技術。目前有關黃精的組織培養和快速繁殖研究主要集中在芽的分化誘導和生根培養等方面，而組培苗移栽種植過程中的問題也逐漸暴露，如成活率不高、出苗時間長等等。本試驗以黃精帶芽根莖為材料, 優化黃精組培快繁體系，以期為黃精工廠化育苗提供技術支持。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

采自湖南郴州境內原生地野生的自然生長發育的黃精根莖，將其用自封袋裝好于4℃保存備用，用帶芽根莖為組織培養的試驗材料。該種野生黃精花期開白色花。

2.2 試驗方法

2.2.1 外植體的選擇與表面消毒條件的篩選

選取新鮮無病蟲害的完整植株，剝去葉片，剪去下部須狀根，用自來水反復清洗根莖。用解剖刀切取帶芽根莖，用多菌靈水浸泡30 min 左右進行表面清洗，再置于流水下沖洗2 h，將預處理過的帶芽根莖放在超凈工作臺上用 75% 酒精浸泡 20 s，用無菌水沖洗3～4 次，再用0.1% 的升汞HgCl2溶液分別消毒浸泡12、15、18 min，然后用無菌水沖洗5～6 次，濾去無菌水后用無菌濾紙吸干備用。再次剝去外包的葉片，保留基部包含生長點的幼芽，將里面的嫩芽接種到制備好的培養基上培養，每處理12瓶，重復3次，每瓶接1個芽，15 d后統計污染數和生長情況。

2.2.2 培養條件

培養基以MS為基本培養基，固定成分為蔗糖30 g，瓊脂粉4.7 g，pH值5.8～6.0。培養室培養條件為室溫23～25℃ ，光照強度為2 000lx左右，光照12 h/d。

2.2.3 芽誘導培養

以MS為基本培養基，將外植體接種于不同激素配比的培養基 M1 ～ M3 上(表1) ，共3個處理，每處理30瓶，每瓶3個芽。30 d 后統計結果。

表1 不同激素配比的芽誘導培養基

2.2.4 增殖、生根培養

將誘導出的芽轉接到增殖培養基M4 ～M7上誘導增殖(表2)，共4個處理，每處理30瓶，每瓶接3個芽。30 d 后統計不定芽的增殖數及生長狀況。

表2 不同激素配比的增殖生根培養基

2.2.5 煉苗與移栽

選取根數達3～4條，根長大于1 cm且長勢良好的黃精組培苗120株進行煉苗。移栽前將組培苗在大棚室內煉苗7 d，前4 d緊閉瓶蓋，后3 d逐漸松蓋，提高抗性和適應性。將小苗根部的培養基清洗干凈，移栽到黃心土∶泥炭土=1∶1的基質中，用0.1%的多菌靈溶液提前噴灑基質進行消毒，于溫室中培養，適度遮蔭，每隔2 d澆水一次，濕度保持在80%以上，待組培移栽苗新葉展開和新根長出后，即可按常規管理。90 d后統計成活率。

2.3 數據統計分析

各相關指標按如下公式計算：

污染率 = 污染個數/接種個數；

萌發率 = 萌發個數/接種個數；

增殖系數=增殖芽總數/接種外植體總數；

生根率 = 生根苗數/接種苗數。

3 結果與分析

3.1 消毒時間對外植體的影響

0.1%HgCl2溶液的消毒時間對黃精帶芽莖根的影響結果見表3。試驗結果表明：消毒時間短，萌發率高, 但污染較嚴重，外植體消毒時間長，污染率雖較低，但外植體出現白化死亡苗的現象。因此，HgCl2對黃精外植體消毒時間在15 min較適宜。在誘導培養基上生長15 d后，芽開始生長，基部明顯膨大，27 d后開始分化出不定芽。

表3 不同消毒時間對外植體誘導存活影響

3.2 不同激素配比對黃精組培苗生長影響

通過不同成分配比培養基的試驗比較，認真觀察記錄各個階段黃精在培養基上生長表現狀況，根據黃精組培苗在各個階段不同培養基的生長表現狀況，進行綜合評價分析(表4)，表現好的用 “++++”表示，較好的用“+++”表示，一般的用 “++” 表示，相對較差的用 “+” 表示。

表4 黃精組培各階段不同培養基表現情況

結果表明：在相同培養條件下，黃精帶芽莖根誘導芽的成活率及長勢對比可見M1>M2、M3，隨6-BA濃度升高處理M3芽誘導率和多芽率也逐漸提高，但隨著IBA濃度升高，且濃度為0.8 mg/L時會出現較多愈傷，不利于芽的誘導，說明在6-BA濃度1.0～2.0 mg/L和IBA濃度0.2～0.8 mg/L范圍內，這2種外源激素共同作用下，濃度較低時更有利于芽的分化。

叢生芽在原瓶中能正常生長，但長勢慢，將原莖根誘導產生的約2 cm 高叢生芽分別接種至不同增殖培養基中繼代增殖，即可產生小苗。組培苗在不同處理培養基中長勢M7>M5>M4、M6，6-BA濃度3.0 mg/L和花寶1號濃度1 g/L時對叢生芽增殖影響最大，平均增值系數為8.5，分化芽直接成苗，苗長勢良好、健壯，葉片呈深綠色，且在接種45 d后可誘導生根，誘導出來的根多且長、較粗壯，植株生根率為100%，平均根數為16.8 ，平均根長為10.82 cm；但處理M4和M6中能分化芽直接成苗，但其組培苗易白化且生長緩慢，無根分化，此現象表明花寶1號對促進增殖生長的影響要強于NAA，由此可確定能夠有效誘導黃精增殖的激素組合是6-BA 、IBA 和花寶1號。組培苗移栽后成活率達到了90%以上(圖1)。

圖1 黃精莖芽組培各階段

4 結論與討論

(1)植物組培快繁技術能有效的解決藥用植物資源短缺的問題[12]。本研究以MS為基本培養基比較各階段不同培養基誘導效果，與前人研究表明黃精屬植物誘芽、增殖適用于MS培養基一致，而以1/2MS基本培養基培養黃精屬組培苗生根與本研究結果不一致[13～17]。相較于周新華[9]建立的多花黃精組培生根技術，本研究選擇的最優培養方法可將增殖和生根同時在同一培養基中培養，培養時間縮短45 d，且生根率高、根數多且長。

(2)不同的外源激素及不同的濃度對黃精組培各階段的影響都不同，且在培養基內加入適當的有機添加物，能夠增強培養物的生長、分化效應[18,19]。本研究誘導叢生芽形成的最適培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+ 0.2 mg/L NAA，最適合叢生芽增殖分化、生根的培養基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+1.0 g/L花寶1號，生根率達100%。試驗中發現 6-BA 能顯著增加黃精叢生芽的分化率，與徐忠傳等[20]研究一致。李慧敏等[21]研究發現，添加花寶1號能促進白芨假鱗莖的誘導，本研究中適當添加花寶1號更有利于苗的生長，這可能與花寶1號培養基中的氮、磷、鉀的配比更適合黃精叢生芽增殖和根的誘導。建議有條件時做更多的栽培基質及其配比試驗，并增加供試株數，以探索更多更好地適合湘南地區黃精生長發育的栽培基質，為黃精栽培提供更為準確的試驗結果。本研究建立的黃精組培快繁體系，為實現工廠化育苗提供了技術支持。