氨基酸同時(shí)消除甲醛和乙二醛的機(jī)理及消減產(chǎn)物的細(xì)胞毒性

林佳鈺，黃才歡，鄭 潔,2，劉 付，歐雋瀅，周 華，胡嘉漫，歐仕益,2,*

（1.暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.焙烤食品安全粵港聯(lián)合創(chuàng)新平臺(tái)，廣東 廣州 510632；3.暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院，廣東 廣州 510632）

甲醛已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)定義為人類(lèi)和動(dòng)物的第一類(lèi)致癌物，對(duì)人體具有巨大的危害。它能夠通過(guò)外源性和內(nèi)源性產(chǎn)生。外源性甲醛主要來(lái)源于環(huán)境和膳食暴露。環(huán)境暴露主要包括煙霧、工業(yè)污染、汽車(chē)尾氣、生物質(zhì)燃燒、化妝品、實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院使用的防腐劑等[1]。在食品加工過(guò)程中，甲醛也可通過(guò)多不飽和脂肪酸氧化、甘氨酸的斯特勒克降解[2]、丙酮醛和乙二醛的降解[3]而產(chǎn)生。內(nèi)源性甲醛可通過(guò)甲醇的氧化而產(chǎn)生。甲醇能通過(guò)水果和植物果膠中的甲酯產(chǎn)生，甲醇在體內(nèi)被迅速吸收并代謝成甲醛。在細(xì)胞內(nèi)，甲醛也可通過(guò)葉酸衍生物的分解、蛋白質(zhì)和核酸的去甲基化而產(chǎn)生[1]。因此，甲醛廣泛存在于熱加工食品及水果、蔬菜、蘑菇、肉類(lèi)和魚(yú)類(lèi)等食品原料中。橙子、火腿、蘑菇和馬鈴薯塊莖中的甲醛含量分別為56.9、293、188、16.5 mg/kg[4-6]。甲醛的亞慢性毒性閾值（以最低基準(zhǔn)質(zhì)量為10%計(jì)算）是2800 μg/（kg·d），為其每日容許攝入量（acceptable daily intake，ADI）的19 倍。因此，甲醛清除劑的開(kāi)發(fā)已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[7]。

乙二醛、丙酮醛和3-脫氧葡萄糖酮等二羰基化合物易誘發(fā)體內(nèi)活性氧產(chǎn)生，引起細(xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡，與生物大分子如蛋白質(zhì)、DNA等發(fā)生不可逆的結(jié)合等[7]。同時(shí)是晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）形成過(guò)程的中間產(chǎn)物。AGEs已被證明與許多慢性疾病，如葡萄糖性視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、糖尿病和腎病等有關(guān)[9]。乙二醛與甲醛一樣，能夠通過(guò)外源性和內(nèi)源性產(chǎn)生。外源性乙二醛的主要來(lái)源有環(huán)境污染和膳食攝入。環(huán)境污染主要包括煙霧、居民原木火災(zāi)、汽車(chē)尾氣等[10]。在不同的食品，如發(fā)酵食品（啤酒、葡萄酒、酸奶、豆醬等）、熱加工食品（面包、曲奇、咖啡和薯?xiàng)l等）、新鮮產(chǎn)品（豆類(lèi)、果蔬、魚(yú)類(lèi)）以及油中均存在乙二醛[11-13]內(nèi)源性乙二醛可通過(guò)碳水化合物和抗壞血酸的自氧化、糖化蛋白的降解和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生[14]。乙二醛的平均暴露量為1000 μg/（kg·d），是其ADI值的5 倍[15]。

甲醛和乙二醛是兩種很活潑的醛，在熱加工過(guò)程中形成后迅速消失。Nowshad等[16]發(fā)現(xiàn)土豆塊莖因自身生化代謝產(chǎn)生16.5 mg/kg甲醛，Bastos等[17]研究表明油炸油（菜籽油）中甲醛含量達(dá)到250 mg/kg，但Wang Wenli等[18]在油條中卻檢測(cè)不到甲醛（檢測(cè)限0.58 nmol/L）。Gobert等[19]采用賴(lài)氨酸與葡萄糖在50 ℃反應(yīng)7 d，測(cè)出添加鄰苯二胺捕捉時(shí)的乙二醛濃度為3.3 mmol/L，而不添加鄰苯二胺捕捉時(shí)乙二醛濃度為0.06 mmol/L，乙二醛的形成量是其終產(chǎn)物中殘留量的55 倍。說(shuō)明在熱加工過(guò)程中，甲醛和乙二醛通過(guò)一些消減途徑而消失了。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，氨基酸在甲醛和乙二醛的消除中發(fā)揮重要作用。一些氨基酸如半胱氨酸、精氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸等在室溫下對(duì)甲醛的消除效果可達(dá)到40%以上[20]，其機(jī)理是氨基酸的親電基團(tuán)如巰基、氨基與甲醛易發(fā)生親核加成反應(yīng)[20]。乙二醛是美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，與氨基酸發(fā)生親核加成反應(yīng)后，發(fā)生Strecker反應(yīng)，是食品中風(fēng)味物質(zhì)如呋喃、吡嗪、吡啶等形成的主要途徑[22]。但乙二醛等二羰基化合物也與氨基酸反應(yīng)生成AGEs。Jiang Kaiyu等[23]通過(guò)模擬胃腸道消化過(guò)程研究幾種蛋白質(zhì)對(duì)幾種活潑羰基化合物如丙烯醛、乙二醛和丙酮醛的消除作用，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的攝入對(duì)幾種活潑羰基化合物具有較好的消除效果，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物氨基酸能夠降低活潑羰基化合物的含量，且消減產(chǎn)物降低了丙烯醛的細(xì)胞毒性。Hu Jiaman等[24]表明甲醛和丙酮醛通過(guò)與甘氨酸、絲氨酸結(jié)合之后形成咪唑鹽而降低了對(duì)正常胃上皮細(xì)胞GES-1和結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2的細(xì)胞毒性。但目前對(duì)氨基酸同時(shí)消除乙二醛和甲醛的機(jī)理還有待研究。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中。GABA是一種新資源食品，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和功能性食品開(kāi)發(fā)中，它在治療癲癇、精神分裂癥、抑郁癥、失眠、高血壓等哺乳動(dòng)物疾病中發(fā)揮著重要作用，它的存在將提高益生元在降低糖尿病患者高血壓方面的潛在能力[25]。L-丙氨酸（L-alanine，Ala）是一種非必需氨基酸，已被GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》列為一種食品添加劑，廣泛用于食品增味。丙氨酸-谷氨酰胺可作為腸外營(yíng)養(yǎng)改善慢性阻塞性肺病急性加重期合并II型呼吸衰竭患者的營(yíng)養(yǎng)狀況、肺功能及生活質(zhì)量[26]。本研究基于甲醛和乙二醛廣泛存在于食品中的實(shí)際，研究GABA和Ala同時(shí)消除甲醛和乙二醛的效率及其消除機(jī)理，揭示食品加工過(guò)程中甲醛和乙二醛的消減途徑；同時(shí)，測(cè)定消減產(chǎn)物在食品中的含量和細(xì)胞毒性，以期為控制食品中的甲醛和乙二醛毒性提供一種新策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙二醛（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%） 上海麥克林生化科技有限公司；甲醛（質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%）、鹽酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%）天津大茂化學(xué)試劑廠；GABA（純度99%）、Ala（純度99%）、2,4-二硝基苯肼（dinitrophenylhydrazine，DNPH）（分析純） 北京百靈威科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國(guó)默克試劑有限公司；氘代甲醇 美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories公司；A-HG型十八烷基鍵合硅膠（octadecylsilyl，ODS）日本東京YMC有限公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀、LC-MS8045三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源） 日本島津儀器公司；N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會(huì)社；SHA-BA恒溫振蕩器 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；X500RQTOF型高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)SCIEX公司；HR-200分析天平 日本A&D公司；600 MHz Avance III型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀瑞士布魯克公司；Scientz-10N型真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；WA-BYM-15SFT壓面機(jī) 江蘇無(wú)錫市麥威電器有限公司；RJ-81型油炸鍋 廣州佛洛麗斯廚具設(shè)備有限公司；XW-80A型微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；5804-R型離心機(jī) 艾本德中國(guó)有限公司；MB-580型酶標(biāo)儀 深圳匯松科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GABA和Ala對(duì)乙二醛和甲醛的清除作用

分別設(shè)置甲醛對(duì)照組：于10 mL具塞比色管中，加入2 mL GABA或Ala，2 mL甲醛和2 mL去離子水；乙二醛對(duì)照組：于10 mL具塞比色管中，加入2 mL GABA或Ala，2 mL乙二醛和2 mL去離子水；實(shí)驗(yàn)組：于10 mL具塞比色管中，分別加入2 mL GABA或Ala，2 mL乙二醛和2 mL甲醛。其中，氨基酸濃度為200 mmol/L，甲醛和乙二醛濃度均為40 mmol/L，在95 ℃條件下反應(yīng)4 h。

反應(yīng)結(jié)束后，參照J(rèn)iang Kaiyu等[23]的檢測(cè)方法，以DNPH檢測(cè)反應(yīng)體系中剩余的甲醛和乙二醛含量。具體檢測(cè)方法如下：將反應(yīng)后溶液稀釋100 倍后，取0.2 mL于5 mL試管中，再加入1 mL DNPH（6 mmol/L，V乙腈/V水=9∶1，采用10%鹽酸將pH值調(diào)為2）和1.8 mL乙腈，在70 ℃衍生2 h。衍生后樣品經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后，采用高效液相色譜儀（配有SPDM20A光電二極管陣列檢測(cè)器）檢測(cè)。具體檢測(cè)條件參照胡嘉漫等[27]的方法，色譜柱為ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為水-乙腈（30∶70，V/V），進(jìn)樣體積5 μL，流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)353 nm（甲醛衍生物）和425 nm（乙二醛衍生物）。甲醛和乙二醛均以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生后進(jìn)樣，每個(gè)樣品采用3 次平行測(cè)定，以濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品中甲醛和乙二醛的殘余量。

1.3.2 消減產(chǎn)物的分離純化

分別稱(chēng)取GABA/Ala、甲醛和乙二醛于裝有20 mL去離子水的100 mL三角瓶中，其中氨基酸濃度為0.5 mmol/L，甲醛和乙二醛濃度為0.1 mmol/L。于95 ℃反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將反應(yīng)液濃縮至1～2 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后，用膠頭滴管加到平衡好的反相硅膠層析柱（ODS填料）上，進(jìn)行柱層析分離。玻璃層析柱規(guī)格為25 mm×600 mm，反相硅膠柱填料體積為200 mL。分離方法參考鄒照佳等[28]，用體積分?jǐn)?shù)5%甲醇溶液平衡柱子后，濕法上樣，以5%甲醇溶液等度洗脫150 mL后開(kāi)始收集樣品，流速為3 s/滴，餾分體積為5 mL。各餾分液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，采用高效液相色譜儀測(cè)定消減產(chǎn)物的純度。色譜柱為ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為水（含0.1%甲酸）-甲醇（95∶5，V/V），進(jìn)樣體積1 μL，流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)208 nm。收集高純度餾分并冷凍干燥48 h，獲得消減產(chǎn)物固體。

1.3.3 消減產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

將純度大于95%的餾分，采用高分辨質(zhì)譜儀獲得消減產(chǎn)物的精確分子質(zhì)量。取20 mg固體樣品溶于550 μL氘代水中，采用NMR儀獲得目標(biāo)產(chǎn)物的一維譜圖（1H NMR、13C NMR、Dept-135NMR）和二維譜圖（HMBC、HSQC、H-H COSY）。

1.3.4 餅干和油炸薯片的制備

餅干配方參考翁婷等[29]的方法，先將烘焙細(xì)砂糖、碳酸氫鈉、碳酸氫銨和氯化鈉放入盆中，稱(chēng)取GABA和Ala。GABA和Ala添加量均為1.5 mg/kg，分別作為GABA對(duì)照組和Ala對(duì)照組，同時(shí)設(shè)置空白組，不添加氨基酸。再用16 g的水少量多次溶解后，與之前準(zhǔn)備的原料混合攪拌均勻。待油融化后加入原料迅速攪拌均勻，加入面粉混合均勻制成面團(tuán)。用壓面機(jī)輥壓2 次，制成餅干后放在吸油紙上，置于提前預(yù)熱30 min的烤箱中，在165 ℃加熱15 min后放置在干燥器中保存。

油炸薯片制備參考郭鴻陽(yáng)等[30]方法，將瀝干的馬鈴薯切片在165 ℃的花生油中油炸3 min后將其取出，瀝干油漬，冷卻至常溫后裝入密封袋置于干燥器中保存。

1.3.5 食品體系中消減產(chǎn)物含量的測(cè)定

食品樣品選自1.3.4節(jié)制備得到的餅干及薯片，以及兩種市售餅干和薯片，餅干和薯片的主要原材料分別為小麥粉和馬鈴薯。將10 g食品樣品碾碎后，取3.0 g于50 mL離心管中，加入5 mL正己烷渦旋5 min后，在10000 r/min離心10 min，去除上清液，此過(guò)程重復(fù)2 次，于通風(fēng)櫥中將殘余正己烷過(guò)夜揮干。加入15 mL 20%甲醇溶液，渦旋5 min后于10000 r/min離心10 min，此過(guò)程重復(fù)2 次，收集上清液后濃縮定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)消減產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。測(cè)定參數(shù)：色譜柱為ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為水（A，含0.1%甲酸）和甲醇（B），流動(dòng)相條件為：0～2 min，95%～5% A、5%～95% B；2～8 min，5% A、95% B；8～10 min，5%～95% A、95%～5% B；10～18 min，95% A、5% B。進(jìn)樣量0.5 μL，流速0.4 mL/min。以正離子模式運(yùn)行，離子源為電噴霧離子源，掃描范圍m/z0～800；離子源溫度300 ℃，去溶劑化溫度250 ℃，毛細(xì)管電壓4000 V，掃描速率1000 Da/s。GABA和Ala來(lái)源的消減產(chǎn)物質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 兩種消減產(chǎn)物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for two reaction products

1.3.6 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

MTT法分別檢測(cè)甲醛、乙二醛、甲醛和乙二醛的混合物，以及兩種消減產(chǎn)物對(duì)人正常胃上皮細(xì)胞（GES-1）的毒性。GES-1采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率為80%左右時(shí)，加入1.5 mL胰酶消化成單細(xì)胞懸液，顯微鏡下計(jì)數(shù)后，向96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（除外周36 孔）中加入100 μL細(xì)胞數(shù)5000 個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液。置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～24 h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。分別加入100 μL不同濃度的藥物孵育細(xì)胞。GABA或Ala咪唑鹽、乙二醛濃度均為0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mmol/L，甲醛濃度為0、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mmol/L，混合醛中甲醛、乙二醛濃度均為0、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mmol/L。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移除孔板中的培養(yǎng)基和藥物，加入100 μL含0.5% MTT的培養(yǎng)基替代藥物，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，移除培養(yǎng)基，加入150 μL/孔二甲基亞砜溶液，使用酶標(biāo)儀振蕩后，于570 nm檢測(cè)吸光度。每個(gè)濃度重復(fù)3 次，細(xì)胞存活率表達(dá)均為。

1.3.7 細(xì)胞活力計(jì)算

式中：A1為藥物組的吸光度；A2為對(duì)照組的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸對(duì)甲醛和乙二醛的消除作用

利用DNPH作為衍生劑檢測(cè)甲醛和乙二醛殘余量，以此評(píng)價(jià)氨基酸對(duì)甲醛和乙二醛的消除效果。分別在生理溫度（37 ℃）和95 ℃研究GABA和Ala對(duì)甲醛和乙二醛的消除效果，發(fā)現(xiàn)低溫下兩種氨基酸對(duì)甲醛和乙二醛的消除效果不高，所以本研究重點(diǎn)探討95 ℃條件下GABA、Ala對(duì)甲醛和乙二醛的消除作用及其機(jī)理，消除效果如表2所示。結(jié)果表明，在混合醛體系中，GABA對(duì)乙二醛的消除效果從55.84%上升至70.64%，Ala對(duì)甲醛的消除效果從2.68%上升至41.33%。此外，GABA對(duì)甲醛具有較好的清除效果，可以達(dá)到84.31%。Ala對(duì)乙二醛的消除效果略低于GABA，只有45.90%。這說(shuō)明，在混合醛體系中，GABA或Ala能夠與一部分的甲醛和乙二醛反應(yīng)從而達(dá)到同時(shí)消除甲醛和乙二醛的目的。

表2 GABA和Ala對(duì)甲醛和乙二醛的消除率（95℃、4 h）Table 2 Removal rates of formaldehyde and glyoxal by reaction with GABA or Ala at 95℃ for 4 h

2.2 消減產(chǎn)物的分離純化

95 ℃水浴反應(yīng)4 h后，GABA-甲醛-乙二醛和Ala-甲醛-乙二醛消減產(chǎn)物的高效液相色譜圖如圖1所示。產(chǎn)物中除了氨基酸之外，還出現(xiàn)了一個(gè)峰面積較大的新產(chǎn)物。GABA與甲醛、乙二醛的消減產(chǎn)物的出峰時(shí)間為7.950 min；Ala與甲醛、乙二醛的消減產(chǎn)物的出峰時(shí)間為6.909 min。

圖1 GABA-甲醛-乙二醛（A）和Ala-甲醛-乙二醛（B）消減產(chǎn)物的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the reaction products from GABAformaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal systems (B)

根據(jù)前期研究，反相硅膠能較好分離氨基酸消除丙烯醛、丙酮醛和甲醛后形成的產(chǎn)物（胡嘉漫[27]、鄒照佳[28]）。因此，本研究采用反相硅膠分離、甲醇洗脫、茚三酮（與氨基酸反應(yīng)顯色）監(jiān)測(cè)，判斷消減產(chǎn)物流出時(shí)間，并采用高效液相色譜測(cè)定其純度，收集純度大于95%的餾分，如圖2所示。

圖2 GABA-甲醛-乙二醛（A）與Ala-甲醛-乙二醛（B）純化消減產(chǎn)物的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the purified reaction products from GABA-formaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal (B) systems

經(jīng)紫外全波長(zhǎng)掃描后，GABA與甲醛、乙二醛的消減產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)為200 nm；Ala與甲醛、乙二醛的消減產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)為209 nm，如圖3所示。

圖3 GABA-甲醛-乙二醛（A）和Ala-甲醛-乙二醛（B）消減產(chǎn)物的全波長(zhǎng)掃描圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of the reaction products from GABA-formaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal (B) systems

2.3 消減產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

純化后的消減產(chǎn)物經(jīng)高分辨質(zhì)譜儀檢測(cè)后，GABA-甲醛-乙二醛和Ala-甲醛-乙二醛消減產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分別為240.1183和212.0870，分子式分別為C11H16N2O4和C9H12N2O4，如圖4所示。

圖4 GABA-甲醛-乙二醛（A）和Ala-甲醛-乙二醛（B）消減產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜圖Fig.4 High-resolution mass spectra of the reaction products from GABA-formaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal (B) systems

GABA-甲醛-乙二醛消減產(chǎn)物的NMR歸屬如表3所示。結(jié)果表明，該消減產(chǎn)物為1,3-雙(3-羧丙基)咪唑。

表3 GABA-甲醛-乙二醛消減產(chǎn)物的NMR歸屬Table 3 NMR spectral assignments of the reaction product from GABA-formaldehyde-glyoxal system

Ala-甲醛-乙二醛消減產(chǎn)物的NMR歸屬如表4所示。結(jié)果表明，該消減產(chǎn)物為1,3-雙(1-羧乙基)咪唑。

表4 GABA-甲醛-乙二醛消減產(chǎn)物的NMR歸屬Table 4 NMR spectral assignments of the reaction product from Ala-formaldehyde-glyoxal system

根據(jù)以上研究結(jié)果，推測(cè)其反應(yīng)機(jī)理如圖5所示，與氨基酸-甲醛-丙酮醛互作機(jī)理[27]相似：GABA或Ala與甲醛生成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物Mannich堿，由于N原子的吸電子效應(yīng)，導(dǎo)致α-C上正電荷堆積，另一分子的GABA或Ala易與之發(fā)生親核加成反應(yīng)形成一個(gè)中間產(chǎn)物。中間產(chǎn)物上的兩個(gè)亞氨基與乙二醛的兩個(gè)羰基發(fā)生親核加成后生成一個(gè)五元環(huán)結(jié)構(gòu)，再脫去兩分子的水，形成咪唑鹽。

圖5 GABA-甲醛-乙二醛（A）和Ala-甲醛-乙二醛（B）消減產(chǎn)物的形成機(jī)理Fig.5 Formation mechanism of the reaction products from GABA-formaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal (B) systems

2.4 食品樣品中消減產(chǎn)物的含量

GABA廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，馬鈴薯粉中含有豐富的游離氨基酸，Elmore等[31]測(cè)得馬鈴薯粉中GABA含量?jī)H次于天冬酰胺，高達(dá)665 mg/kg。張志清等[32]通過(guò)高效液相色譜法測(cè)得不同的小麥品種中GABA含量為2.38～52.59 mg/kg。丙氨酸在馬鈴薯粉中的含量高達(dá)259 mg/kg[31]，同時(shí)也是小麥中的一種主要氨基酸[33]。為此，采用制備的咪唑鹽標(biāo)準(zhǔn)樣品，建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)了兩種市售油炸薯片（復(fù)合薯片）和餅干中咪唑鹽含量，其中油炸薯片中GABA、Ala咪唑鹽含量分別為（188±8）μg/kg和（156±1）μg/kg，餅干分別為（149±23）μg/kg和（27±4）μg/kg。

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自制的鮮切油炸薯片和餅干中的咪唑鹽含量，結(jié)果表明，鮮切油炸薯片中GABA、Ala咪唑鹽含量分別為（2666±218）、（855±91）μg/kg，均高于自制餅干中的GABA、Ala咪唑鹽含量，說(shuō)明薯片中有更多的GABA和Ala與甲醛和乙二醛結(jié)合生成了咪唑鹽，推測(cè)可能與原材料中氨基酸的含量有關(guān)。為此，在制作餅干時(shí)分別添加了1.5 mg/kg的GABA和Ala（即16.9 μmol/kg和14.6 μmol/kg），發(fā)現(xiàn)GABA和Ala的添加使兩者的咪唑鹽含量分別從（705±66）μg/kg和（67±3）μg/kg增加到（1883±16）μg/kg和（616±38）μg/kg。GABA、Ala咪唑鹽的相對(duì)分子質(zhì)量分別為240和212，氨基酸添加后，咪唑鹽含量分別增加了4.9 μmol/kg和2.6 μmol/kg，即兩種氨基酸對(duì)甲醛和乙二醛的消除率分別達(dá)到34%和15%。在乙二醛和甲醛（與氨基酸物質(zhì)的量比為1∶1∶5）同時(shí)存在的模擬體系中（表2），GABA對(duì)甲醛和乙二醛的消除率分別為16.7%和14%，Ala對(duì)甲醛和乙二醛的消除率分別為8.3%和9.2%（物質(zhì)的量比）。說(shuō)明在焙烤溫度更高的餅干（165 ℃）中，兩種氨基酸對(duì)甲醛和乙二醛的消除率高于模擬體系。

2.5 消減產(chǎn)物的細(xì)胞毒性

上述研究表明，食品中GABA與Ala可通過(guò)與甲醛、乙二醛反應(yīng)形成咪唑鹽而消除甲醛和乙二醛，但咪唑鹽的毒性未知。胃是人體主要的消化道器官，食物經(jīng)口腔、食管傳遞后進(jìn)入胃進(jìn)行儲(chǔ)藏和消化，并存在部分吸收。本研究采用人正常胃上皮細(xì)胞探索甲醛、乙二醛和消減產(chǎn)物的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，甲醛、乙二醛和消減產(chǎn)物的細(xì)胞毒性存在顯著差異，如圖6所示。GES-1細(xì)胞活力隨著甲醛濃度的增加急劇降低，在甲醛濃度為0.20 mmol/L時(shí)細(xì)胞活力僅剩下19.0%。較甲醛而言，乙二醛對(duì)GES-1細(xì)胞的毒性較低，在乙二醛濃度達(dá)到2.0 mmol/L時(shí)，細(xì)胞活力為55%。在甲醛-乙二醛混合醛體系中，GES-1細(xì)胞活力隨著混合醛濃度的增加急劇降低，在混合醛濃度為0.20 mmol/L時(shí)，細(xì)胞活力僅剩下14.0%，較0.20 mmol/L甲醛處理的細(xì)胞活力更低，說(shuō)明混合醛對(duì)細(xì)胞存在協(xié)同致毒效應(yīng)。氨基酸與兩者形成咪唑鹽后，細(xì)胞毒性顯著降低。Ala和GABA咪唑鹽濃度為4 mmol/L時(shí)，GES-1細(xì)胞活力仍保持在97%和113%，說(shuō)明在4 mmol/L下，消減產(chǎn)物對(duì)GES-1細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用。

圖6 甲醛、甲醛-乙二醛混合醛（A）和乙二醛、GABA咪唑鹽和Ala咪唑鹽（B）對(duì)GES-1細(xì)胞活力的影響Fig.6 Effect of formaldehyde and its mixture with glyoxal (A),and glyoxal and imidazole salts formed with GABA and Ala on the cell viability of GES-1 cells (B)

3 結(jié)論

甲醛、乙二醛和游離氨基酸共存于熱加工食品中。本研究表明，GABA和Ala可同時(shí)消除甲醛和乙二醛，且兩種有害醛共存時(shí)對(duì)氨基酸消除它們產(chǎn)生一定的協(xié)同效果。氨基酸消除混合醛的機(jī)理不同于單一醛，它是兩分子氨基酸分別與一分子甲醛和乙二醛反應(yīng)、脫去3分子水后形成咪唑鹽。咪唑鹽的形成顯著降低了甲醛和乙二醛的細(xì)胞毒性。鑒于咪唑鹽在油炸和焙烤條件下都可形成，且添加GABA和Ala會(huì)增加餅干和油炸薯片中咪唑鹽含量，說(shuō)明采用氨基酸同時(shí)減控?zé)峒庸な称分屑兹┖鸵叶┚哂泻芎玫膽?yīng)用前景。