基于電子鼻與HS-SPME-GC-MS技術對不同產地黃觀音烏龍茶香氣差異分析

邵淑賢，徐夢婷，林燕萍，陳瀟敏，方德音，蔡捷英，王金煥，金 珊,*，葉乃興,*

（1.福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002；2.武夷學院茶與食品學院，福建 武夷山 354300；3.云霄縣茶葉科學研究所，福建 漳州 363300）

福建是我國最大的產茶省，烏龍茶作為第三大茶類，主要產區集中于閩北、閩南、廣東及中國臺灣等地，如武夷巖茶、鐵觀音、鳳凰單叢和東方美人等[1]。由于茶樹品種、產地和加工工藝等諸多因素影響，各種烏龍茶形成了獨特的品質特征，香氣作為評價茶葉品質的重要感官因素之一，也是決定茶葉香型的主要依據[2-3]。黃觀音是福建省農業科學院茶葉科學研究所從鐵觀音（♀）和黃旦（♂）人工雜交F1代中單株選育成的高香型國家級優良茶樹品種。采用黃觀音鮮葉原料制成的烏龍茶品質優異，滋味醇厚甘爽，香氣特征趨向父本[4]。黃觀音是福建省的主栽茶樹品種之一，在云霄、武夷山等地大面積種植，茶葉具有明顯的地域特色和品質特征，其市場認可度和消費者喜愛程度也各有不同。近年來茶葉區域品牌建設越來越受到人們重視，因此對不同產地茶葉香氣品質差異的研究具有一定的研究意義和研究價值。

茶葉香氣成分易揮發，提取過程中易受外界條件影響，有效的香氣測定方法至關重要。電子鼻是一種快速無損檢測的新型人工智能嗅覺裝置，但是無法分離、鑒定樣品的香氣成分[5]。頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）法在香氣富集過程實現自動化，具有便捷、快速等優點，HS-SPME-氣相色譜-質譜（HS-SPME-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）通常用于檢測和鑒定茶葉香氣成分[6-8]。呂世懂等[9]研究發現，不同產區的烏龍茶香氣成分差異很大，并與加工工藝存在一定關聯。嵇偉彬等[2]對不同產區有代表性的烏龍茶樣品分析結果表明，烏龍茶感官香型可能與品種、加工工藝密切相關。目前烏龍茶香氣對不同品種、產地和加工工藝等方面綜合比較研究較多，而關于同一茶樹品種不同產地烏龍茶香氣物質的比較研究相對較少，尤其關于黃觀音烏龍茶特征香氣成分的產地差異鮮有報道。

云霄黃觀音烏龍茶品質優異，獨具“花香蜜韻”，云霄縣已將“云霄黃觀音”打造成茶葉公共品牌，武夷山作為烏龍茶的發源地，在茶葉發展史上具有重要地位[10]。因此，為更全面地了解不同產地對黃觀音烏龍茶品質的影響，本研究選取云霄黃觀音和武夷黃觀音烏龍茶樣品，采用電子鼻與HS-SPME-GC-MS對其香氣特征進行測定分析，并建立黃觀音烏龍茶的產地判別模型，旨在為兩地黃觀音烏龍茶的品質差異和產地鑒別提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品為2020年與2021年4月中上旬黃觀音烏龍茶；鮮葉采摘標準為開面采，采至三四葉嫩梢；云霄黃觀音結合閩南烏龍茶與閩北烏龍茶工藝，其工序為：萎凋→做青→殺青→揉捻→干燥；武夷黃觀音采用閩南烏龍茶工藝，其工序為：萎凋→做青→殺青→揉捻→烘焙。云霄黃觀音烏龍茶由云霄縣茶葉科學研究所分別提供10 份2020年和10 份2021年份市售代表性茶樣，武夷黃觀音烏龍茶由武夷學院茶與食品學院分別提供10 份2020年和10 份2021年份市售代表性茶樣。

氯化鈉（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；正己烷（色譜純） 德國Merck公司；標準品（色譜純） 美國BioBioPha/Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

iNose型電子鼻 上海昂申智能科技有限公司；8890-5977B GC-MS聯用儀、120 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、DB-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國安捷倫公司；MM400球磨儀 德國Retsch公司；MS105DU電子天平 美國Mettler Toledo公司；固相微萃取裝置、老化裝置、樣品加熱箱 瑞士思特斯分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 電子鼻測定

1.3.1.1 樣品前處理

將黃觀音烏龍茶樣品經研磨后過40 目篩，稱取3.00 g（精確值0.001 g）茶粉于60 mL頂空瓶中，在65 ℃水浴鍋內平衡50 min后開始檢測。

1.3.1.2 電子鼻檢測參數

氣體流量為0.40 L/min；采樣時間為300 s；進樣準備等待時間為15 s；樣品清洗時間為300 s；操作環境溫度26 ℃。

1.3.2 GC-MS測定

1.3.2.1 樣品前處理

將黃觀音烏龍茶樣品經液氮研磨后，渦旋混合均勻，稱取約1.00 g樣品，加入含有飽和氯化鈉溶液和10 μL（50 μg/mL）正丁烷內標溶液的15 mL頂空瓶中，并使用配備硅膠頂空隔墊的鉗口蓋密封頂空瓶。頂空瓶于100 ℃恒溫條件下振蕩5 min后，進行全自動HS-SPME樣本萃取。

1.3.2.2 HS-SPME條件

萃取頭在老化裝置中，250 ℃溫度下老化5 min后，插入樣品頂空瓶中，頂空萃取15 min，并在250 ℃下解吸5 min，進行GC-MS分離鑒定。

1.3.2.3 GC-MS條件

GC條件：DB-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3.5 min；以10 ℃/min升至100 ℃；再以7 ℃/min升至180 ℃；最后以25 ℃升至280 ℃，保持5 min。不分流進樣模式下，載氣（氦氣）為恒流1.2 mL/min（純度不小于99.999%）；溶劑延遲3.5 min；進樣口溫度250 ℃。

MS條件：電子電離源；離子源、四極桿和質譜接口溫度分別為230、150 ℃和280 ℃；電子能量70 eV，掃描方式為全掃描模式；質量掃描范圍m/z50～500。

1.4 數據處理

基于MWGC數據庫，對樣本的代謝物進行質譜定性，定量通過與內標物的峰面積比較，得到香氣成分的含量，單位為μg/g，即：香氣成分含量=香氣成分物質峰面積×內標物含量/內標物峰面積。Origin 2018軟件繪制雷達圖、指紋圖譜；TBtools繪制熱圖；SIMCA 14.1軟件進行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），計算預測變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）；并結合SPSS 24.0軟件進行單因素分析，以P＜0.05，VIP≥1為條件篩選差異香氣成分；利用R軟件“factoextra”包進行主成分分析（principal component analysis，PCA）結果提取和可視化作圖，結合支持向量機（support vector machine，SVM）分類方法建立黃觀音烏龍茶產地判別模型。

2 結果與分析

2.1 基于電子鼻技術的不同產地黃觀音烏龍茶品質差異分析

如圖1所示，兩地黃觀音烏龍茶在得分散點圖的橫軸上實現了產地區分，自變量擬合指數（）為0.999，因變量擬合指數（）為0.863，模型預測指數（Q2）為0.777，對兩地黃觀音烏龍茶的預測率為77.7%。其中，云霄黃觀音均勻分布在橫軸的負半軸，武夷黃觀音均勻分布在橫軸的正半軸。同產地的黃觀音烏龍茶重復性良好，說明不同產地黃觀音烏龍茶香氣存在一定區別。

圖1 不同產地黃觀音烏龍茶電子鼻的OPLS-DA（A）及雷達圖（B）Fig.1 OPLS-DA plot (A) and radar chart (B) of Huangguanyin oolong tea from different geographical origins

結合表1數據繪制的電子鼻特征氣味雷達指紋圖（圖1B），可看出10 個傳感器對兩地黃觀音烏龍茶揮發性成分的響應值不同。在10 個傳感器中，S2、S4、S5、S6和S10這5 個傳感器對云霄黃觀音響應值顯著高于武夷黃觀音（P＜0.05，VIP＞1），認為這些傳感器可能在本實驗OPLS-DA模型中的貢獻較大，其中S4傳感器對有機溶劑敏感，而茶葉中的常見芳香物質種類（醇類、醛類、酮類、酯類及含氮化合物）也被包含于有機溶劑中[5]。

表1 不同產地黃觀音烏龍茶的電子鼻響應值Table 1 Electronic nose response values for Huangguanyin oolong tea from different geographical origins

2.2 不同產地黃觀音烏龍茶香氣成分特征分析

為研究不同產地黃觀音茶樹品種制成烏龍茶的香氣特征，利用HS-SPME與GC-MS聯用的方法對40 種烏龍茶樣品的香氣化合物成分及相對含量進行分析鑒定。由表2可知，共檢測到79 個共有香氣成分，其中醇類化合物14 種、醛類化合物11 種、酮類化合物9 種、酯類化合物24 種、酸類化合物3 種、萜烯類化合物12 種、烴類化合物5 種和雜環類化合物1 種。以79 個共有香氣組分作為因變量，不同產地作為自變量，通過OPLS-DA（圖2A），可以實現2 個產地的黃觀音烏龍茶樣品有效區分。本次分析中的自變量擬合指數（）為0.782，因變量擬合指數（）為0.927，模型預測指數（Q2）為0.576，R2和Q2超過0.5表示模型擬合結果可接受[12]。經過200 次置換檢驗，如圖2B所示，Q2回歸線與縱軸的相交點小于0，說明模型不存在過擬合，模型驗證有效，認為該結果可用于茶葉香氣的產地鑒別分析。

圖2 不同產地黃觀音烏龍茶的OPLS-DA（A）、模型交叉驗證結果（B）及香氣指紋圖譜（C）Fig.2 OPLS-DA (A),permutation test of permutation test of OPLSDA model (B) and aroma fingerprints (C) of Huangguanyin oolong tea from different geographical origins

表2 不同產地黃觀音烏龍茶的香氣成分Table 2 Aroma components of Huangguanyin oolong tea from different geographical origins

續表2

根據這些香氣成分的峰保留時間、峰面積值等相關參數建立兩地黃觀音烏龍茶香氣指紋圖譜（圖2C），不同產地樣品香氣指紋圖譜之間具有明顯差異。兩地黃觀音烏龍茶樣品香氣組分種類相似，但各類物質總含量有差異，含量最高的香氣組分是醇類，其次是雜環類、酯類和萜烯類，其中云霄黃觀音中的酯類和雜環類化合物含量顯著高于武夷黃觀音（P＜0.05）。

醇類通常具有花果香氣特征[12]，在烏龍茶做青過程中，內源性糖苷酶將芳香糖苷水解成醇[13]。在云霄黃觀音與武夷黃觀音中共鑒定出14 種醇類，分別占其總質量的32.45%和36.29%。香葉醇、苯乙醇、反式-橙花叔醇、芳樟醇及芳樟醇氧化物II作為烏龍茶的特征香氣物質[14]，分別占云霄黃觀音與武夷黃觀音醇類物質的74.34%和76.56%。前人研究結果認為反式-橙花叔醇是評定烏龍茶品質的關鍵香氣成分之一[13,15]，本實驗結果中發現黃觀音烏龍茶中具有較高含量的反式-橙花叔醇，分別占云霄黃觀音與武夷黃觀音香氣總質量的10.42%和19.49%，且云霄黃觀音中的反式-橙花叔醇含量顯著高于武夷黃觀音（P＜0.05）。芳樟醇氧化物II作為芳樟醇的氧化產物，其含量隨著烏龍茶烘焙時間延長而增加[16]，但在兩地黃觀音烏龍茶中不存在顯著差異；吲哚是賦予烏龍茶花香特征的雜環類化合物[17]，分別占云霄黃觀音與武夷黃觀音香氣總質量的23.14%和15.56%；酯類化合物以乙酸乙酯、茉莉內酯和茉莉酸甲酯為主，其中具有奶香、果香特征的茉莉內酯和茉莉花香氣特征的茉莉酸甲酯[18]，在兩地黃觀音烏龍茶中存在顯著差異（P＜0.05）。萜烯類化合物以β-石竹烯和(順)-β-金合歡烯為主，但這2 種香氣物質在兩地黃觀音烏龍茶中不存在顯著差異。

2.3 不同產地黃觀音烏龍茶香氣成分差異分析

為了進一步分析不同香氣成分對區分兩地黃觀音烏龍茶的貢獻率，根據P＜0.05且VIP＞1的標準，篩選出17 種兩地黃觀音烏龍茶的差異香氣物質（圖3），其中醇類4 種、醛類4 種、酮類3 種、酯類4 種、萜烯類1 種和雜環類1 種。區域A為云霄黃觀音含量較突出的9 種香氣成分，包括反式-橙花叔醇、吲哚、茉莉酸甲酯、茉莉酸內酯等。區域B為武夷黃觀音較高含量的8 種香氣成分，包括芳樟醇、月桂烯、癸醛、己醛等。

圖3 不同產地黃觀音烏龍茶的差異香氣成分聚類熱圖Fig.3 Heatmap of differential aroma components between Huangguanyin oolong tea from different geographical origins

2.3.1 差異香氣的OAV分析

香氣成分含量的高低并不能作為夠判定茶葉香氣特征依據，通常賦予茶葉香氣特征的是具有較高OAV的香氣成分[19]。Guo Xiangyang等[18]研究認為單個香氣成分對烏龍茶整體香氣的貢獻取決于其濃度和氣味閾值。前人研究通過計算OAV評價單個香氣對茶葉整體香氣的貢獻度，OAV大于1時認為該香氣組分對茶葉香氣具有一定影響性，OAV大于10時認為該香氣組分對茶葉整體香氣貢獻極大[4]。根據文獻報道的香氣成分的閾值和屬性描述，計算兩地黃觀音烏龍茶差異香氣成分的OAV。結果表明（表3），共有14 種香氣成分可計算OAV，且OAV均大于1，認為這些差異香氣物質可能對判別兩地黃觀音烏龍茶的香氣特征具有重要作用。其中，兩地黃觀音烏龍茶中的芳樟醇、反式-橙花叔醇、癸醛、茉莉酮、茉莉酸甲酯和吲哚的OAV均高于100，認為這些香氣物質可能是黃觀音烏龍茶中的關鍵香氣成分。

表3 不同產地黃觀音烏龍茶的差異香氣成分OAVTable 3 OAVs of differential aroma components between Huangguanyin oolong tea from different geographical origins

與云霄黃觀音相比，武夷黃觀音中OAV較為突出的芳樟醇（518.95）、癸醛（396.05）和月桂烯（129.34）等，多具有花果香特征。其中武夷黃觀音中癸醛和月桂烯的OAV超過云霄黃觀音的1.5 倍以上。與武夷黃觀音相比，云霄黃觀音中OAV較為突出的香氣成分多具花香特征，包括茉莉酸甲酯（1560.28）、吲哚（420.42）、茉莉酮（312.90）、反式-橙花叔醇（147.26）和茉莉內酯（93.10）等。其中，云霄黃觀音中具有茉莉花香氣的茉莉酸甲酯和茉莉酮的OAV超過武夷黃觀音的2 倍以上。由于烏龍茶工藝的特殊性，茶葉細胞完整度和細胞活性在加工過程中保持時間較長，能夠充分地進行酶促反應。而在加工過程葉片受到了多種脅迫，尤其是做青過程的綜合脅迫響應，即晾青的失水反應和搖青的持續性機械損傷[21]。做青是烏龍茶關鍵的加工工序，是形成半發酵茶獨特香味的關鍵[14]，前人研究結果表明做青過程中的低溫脅迫與機械脅迫能夠促進烏龍茶中吲哚[22]、茉莉內酯[23]、茉莉酸甲酯[24]和反式-橙花叔醇[25]含量的提高；茉莉酮是半發酵茶中具有類似茉莉花香氣的脂肪酸衍生物[26]，在做青過程中的含量顯著增加[27]；Zeng Lanting等[28]研究也表明吲哚、反式-橙花叔醇和茉莉內酯含量累積與烏龍茶獨特的加工工藝之間存在密切聯系。

在做青過程中的機械損傷對葉片細胞造成了一定程度破壞，影響了細胞內酶促反應的進程從而影響對烏龍茶特征香氣物質的產生。Gui Jiadong等[29]研究發現茉莉內酯和吲哚在發酵前期的含量顯著提高，但隨著持續發酵其含量緩慢減少，可能與葉片細胞破損程度相關[17,26]，烏龍茶的做青強度與發酵程度密切相關，酸性強度隨發酵程度逐步增強，而賦予高品質茶葉蘭花香氣的茉莉酸甲酯易在酸或高溫度條件下轉化[30-31]；王贊等[32]研究表明，芳樟醇在重做青烏龍茶中含量較高。茉莉內酯、吲哚、茉莉酸甲酯和芳樟醇在兩地黃觀音烏龍茶含量中的差異可能與其發酵程度密切相關。云霄黃觀音結合閩南與閩北烏龍制作工藝，具有“重搖、搖次少、輕發酵”的特點，而武夷黃觀音則具有閩北烏龍茶的“輕搖、搖次多、重發酵”特點，認為兩地黃觀音烏龍在這些香氣成分含量上的差異可能與不同做青工藝有關。

2.3.2 基于差異香氣成分的產地判別分析

為了獲得更準確和直觀的分類結果，依據篩選出的17 個具有組間差異的香氣成分，對40 個不同產地黃觀音烏龍茶香氣數據進行產地判別分析。

使用PCA對差異香氣數據進行降維處理，得到前2 個PC的兩地黃觀音烏龍茶得分散點圖（圖4A）。如圖4B1所示，PC累計比值越接近1，表示PCA模型的可靠性越強；如圖4B2所示，各PC的可解釋變異為PC1＞PC2＞PC3＞PC4＞PC5，其中PC1和PC2的方差貢獻率分別為47.41%、16.86%，累計方差貢獻率達到64.27%，認為選取PC1、PC2分析樣本具有較好的可靠性。SVM模型依據前2 個PC，并將樣本隨機分為70%訓練集和30%測試集，SVM模型判別率達到83.33%（圖4C），認為這17 種差異香氣物質能夠用于判定來自云霄與武夷山的黃觀音烏龍茶。芳樟醇、反式-橙花叔醇、茉莉內酯、茉莉酸甲酯和吲哚作為烏龍茶的重要香氣成分[9]，在兩地黃觀音烏龍茶之間的含量差異達到顯著水平。對這幾種重要差異香氣成分進行PC降維處理，PC1和PC2的方差貢獻率分別為62.17%、19.85%，累計方差貢獻率達到82.02%。SVM模型依據前兩個PC，并將樣本隨機分為70%訓練集和30%測試集，結果表明SVM模型判別率為100%（圖4D）。認為芳樟醇、反式-橙花叔醇、茉莉內酯、茉莉酸甲酯和吲哚的含量與SVM模型相結合，是一種有效、準確鑒別云霄與武夷山黃觀音烏龍茶的方法。

圖4 不同產地黃觀音烏龍茶差異香氣成分的PCA（A）、可解釋變異圖（B）、SVM模型（C）及5 種香氣成分SVM模型（D）Fig.4 Principal component analysis (PCA) plot (A),cumulative contribution and explained variation of first five principal components (B),SVM model based on differential aroma components (C) and SVM model based on five important aroma components (D) in Huangguanyin oolong tea from different geographical origins

3 結論

采用電子鼻結合HS-SPME-GC-MS技術，對不同產地的黃觀音烏龍茶的香氣成分進行比較分析，結果表明不同產地黃觀音烏龍茶的香氣成分在種類上相似，而在含量上差異顯著，且具有明顯的產地特征。不同產地黃觀音烏龍茶中共檢測出79 個共有香氣成分，基于P值與VIP值，進一步篩選到與烏龍茶香氣品質相關的茉莉酸甲酯、吲哚、茉莉酮、反式-橙花叔醇和茉莉內酯等17 個香氣物質在兩地黃觀音樣品中的含量差異達到顯著水平。通過對兩地黃觀音烏龍茶的差異香氣物質進行OAV對比分析，結果表明云霄黃觀音中OAV較高的茉莉酸甲酯、吲哚、茉莉酮、反式-橙花叔醇和茉莉內酯等香氣成分多具花香特征，而武夷黃觀音中OAV較高的芳樟醇、癸醛、月桂烯、異戊醛和己醛等香氣成分多具有花果香氣特征；基于差異香氣物質對兩地黃觀音烏龍茶進行PCA，前2 個PC的累計方差貢獻率達到64.27%，依據前2 個PC構建的SVM模型進行黃觀音烏龍茶產地判別率達到83.33%，對樣品的5 個重要香氣成分（芳樟醇、反式-橙花叔醇、茉莉內酯、茉莉酸甲酯和吲哚）構建的SVM模型判別率為100%。

本實驗對影響兩地黃觀音烏龍茶品質的香氣成分進行分析比較，為辨別云霄與武夷黃觀音烏龍茶提供理論參考。由于不同產地黃觀音烏龍茶的香氣品質可能受到其他因素的影響，還需進一步控制變量并增加實驗樣本，同時本課題組在后續的研究中，將進一步結合GC-嗅聞、礦物質元素和氣相色譜離子遷移譜等技術，為云霄黃觀音和武夷黃觀音烏龍茶的品質評定提供客觀依據。