牡丹花蕊蛋白對面團和面筋蛋白特性的影響

羅 磊，夏迎利，楊浩昆，趙一帆，李瀚姝，馬 瀟

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南省農產品干燥裝備工程技術研究中心，河南 洛陽 471000）

牡丹花色澤艷麗，素有“花中之王”的美譽，我國自古就有食用牡丹花的習慣，現已形成多種地方特色名吃，如牡丹鮮花餅、牡丹花銀耳湯等[1]。2013年丹鳳牡丹被國家衛生部列為一種新資源食品原材料，被眾多研究者開發與利用。

我國牡丹種植面積已超過30萬 畝，除具有極高的觀賞價值外，花期過后其籽可產油，根皮可入藥，花瓣宜食用，而牡丹花蕊由于沒有得到很好的開發，出現大量資源浪費的現象。牡丹花蕊是牡丹之精華，碳水化合物和蛋白質含量高，脂肪酸構成較健康，能降低人體血壓，具有較好的抗氧化效果，對人體生理代謝以及膳食結構的調節具有重要作用。研發者應加大對牡丹花蕊功能成分、加工特性以及食品開發方面的研究，為牡丹花蕊資源進一步開發利用提供依據，有利緩解資源浪費的局面。

近年來，國內外眾多研究者發現將植物蛋白添加到面粉中可以提高面制品的營養品質，改善面團的特性，影響面筋網絡結構，從而可以提高面制品的質量[2-3]。大豆蛋白是一種高純度蛋白，因其產量高、價格便宜、營養豐富，常被作為食品改良劑應用于肉制品、面制品、乳制品等食品中[4]。有研究表明，將大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）添加到面粉中，蛋白質和面筋蛋白含量顯著增高，面條口感較好，斷條率明顯減少。在生產面包時加入不超5%的SPI可改善面包表皮色澤，增大面包體積，增加風味，營養增補效果明顯。應用于餅干生產時，可提高其保水性，延長產品貨架期[5]。牡丹花蕊作為藥食同源的植物原料，蛋白質含量占干質量的23.73%，氨基酸組成合理，其中必需氨基酸占比為38.26%，是優質的蛋白質資源[6]。因此，本實驗以SPI添加量作比較，研究牡丹花蕊蛋白對面團質構和動態流變學特性影響以及對面筋蛋白二硫鍵含量、表面微觀結構、二級結構等特性的影響，為牡丹花蕊蛋白在面制品開發應用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹花蕊：丹鳳，采自洛陽牡丹園；小麥粉（標準粉：蛋白質質量分數10.07%，水分質量分數13.58%）一加一天然面粉有限公司；SPI 源葉生物科技有限公司；L-半胱氨酸 天津市光復精細化工研究所；乙二胺四乙酸 天津市凱通化學試劑有限公司；甘氨酸上海藍季生物公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)合肥博美生物科技有限公司；β-巰基乙醇 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SMS TA.XT Epress Enhanced食品物性分析儀 美國Stable Micro Systems Ltd.公司；VERTEX70傅里葉變換中遠紅外光譜儀 德國Bruker公司；DHR2流變儀 美國TA儀器有限公司；TM3000臺式電鏡 日立高新技術公司；DSC-1型差示掃描量熱儀 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 面團的制作

以小麥粉質量為基準，參考韓暢等[7]的方法略作修改，將牡丹花蕊粗蛋白粉末和SPI分別按照0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例與小麥面粉混合均勻，稱取適量面粉于揉面機內，加入65%蒸餾水，充分攪拌均勻后，將面團用保鮮膜包好，置于4 ℃冰箱儲存備用。

1.3.1.2 面筋蛋白的制備

參考馮勇等[8]的方法稍作修改，采用手洗法進行面筋蛋白的洗滌。分別稱取小麥面粉0%、2%、4%、6%、8%、10%的花蕊蛋白和SPI與面粉混合均勻，加入65%蒸餾水混合揉成均勻面團，在室溫下靜置20 min，然后用蒸餾水反復水洗，期間要注意及時換水以利于洗滌效率高，洗至水澄清遇碘不變藍即得到面筋蛋白。然后將其進行冷凍干燥處理，得到干燥的面筋蛋白放置自封袋4 ℃冰箱貯存備用。

1.3.2 面團質構性質的測定

利用食品物性分析儀對面團質構性質進行測定，測定前將面團制作為邊長為1.5 cm的正方體，選擇P/36R圓柱形探頭，測試前速率為2.0 mm/s，測試中速率為1.0 mm/s，測試后速率為1.0 mm/s，壓縮比為50%，觸發力為5.0 g，兩次壓縮間隔為5 s，數值精確到0.01。

1.3.3 面團流變學特性的測定

稱取適量面團，放置流變儀平臺上，參考楊勇等[9]的方法略有改動。采用頻率掃描模式研究牡丹花蕊蛋白和SPI對面團動態流變學的影響。選用直徑為40 mm的平板，下降平板至1050 μm，刮去平板外多出的樣品，然后下降至剪切間隙為1000 μm，設置平臺溫度25 ℃，應變量1.0%，掃描頻率為1.0～10.0 Hz，測定儲能模量（G’）和損耗模量（G”）的變化。

1.3.4 面筋蛋白微觀結構分析

參照Gómez等[10]的方法略有修改。將冷凍干燥后的面筋蛋白，使其自然斷面，用鑷子選出大小合適、樣品表面平整的樣品，用導電膠帶把樣品固定在電鏡樣品臺，然后放置噴金儀上進行噴金處理使樣品導電，將處理好的樣品置于掃描電子顯微鏡下，調節最佳視野和放大倍數進行觀察并拍照。

1.3.5 面筋蛋白二級結構分析

采用傅里葉變換中遠紅外光譜儀進行面筋蛋白二級結構分析。參考馬薇薇等[11]的方法略作修改，取樣品1 mg與干燥KBr 100 mg充分研磨，用壓片機壓成透明或均勻半透明的薄片，在4 cm-1分辨率下進行掃描測定，掃描波段為4000～400-1對每個樣品掃描32 次。用Omnic8.2和Perkfit4.0軟件選取酰胺I帶、基線校準、卷積處理、二階導數擬合、多次擬合等，通過計算峰面積確定各二級結構的相對含量。

1.3.6 面筋蛋白巰基和二硫鍵的測定

參考張瑩瑩等[12]的方法略有改動。Ellman試劑：將20 mg 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶于5 mL Tris-Gly緩沖液中，配制0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，尿素8 mol/L，1% SDS和3 mmol/L EDTA），混合均勻后，配制成2 mmol/L的L-半胱氨酸標準溶液，梯度稀釋為0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mmol/L和0.06 mmol/L的標準溶液。分別取4 mL標準溶液加入0.1 mL的Ellman試劑，混合均勻，在室溫下進行顯色反應20 min后，以等量蒸餾水替代標準溶液作為空白對照，在412 nm波長處測定吸光度并繪制標準曲線。

游離巰基含量測定：分別稱取不同添加量面筋蛋白0.05 g，使其溶解于10 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液中，反應30 min后，在8000 r/min離心20 min，收集上清液。分別取4 mL標準溶液加入0.1 mL的Ellman試劑，混合均勻，在室溫下進行顯色反應20 min后，以蒸餾水替代樣品作為空白對照，在412 nm波長處測定吸光度，根據繪制的L-半胱氨酸標準曲線計算得到面筋蛋白中的游離巰基含量。

二硫鍵含量測定：取測定游離巰基中離心后的上清液1 mL，加入4 mL的0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液和0.1 mLβ-巰基乙醇充分混勻，在25 ℃水浴鍋內保溫1 h，再加入10 mL的12%三氯乙酸溶液，混勻后繼續在25 ℃水浴鍋內保溫1 h，8000 r/min離心20 min后取沉淀，并用三氯乙酸清洗沉淀3 次。加入10 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液使其復溶，然后加入0.1 mL的Ellman試劑，在室溫下進行顯色反應20 min后，以蒸餾水替代樣品作為空白對照，在412 nm波長處測定吸光度，根據繪制的L-半胱氨酸標準曲線計算得到面筋蛋白中的總巰基含量。

面筋蛋白二硫鍵含量按下式計算：

式中：SHT為總巰基含量/（μmol/g）；SHF為游離巰基含量/（μmol/g）。

1.4 數據處理

實驗數據采用SPSS statistics 23進行顯著性分析，運用Excel 2019對數據進行統計分析，利用Origin 8.5軟件作圖，用Omnic 8.2和Perkfit4.0進行二級結構圖譜分析，每組樣品做3 次平行實驗。

2 結果與分析

2.1 面團質構性質分析

如表1所示，SPI和牡丹花蕊蛋白不同添加量對面團質構的影響規律基本一致，都是隨著添加量增加面團的硬度、黏著性、咀嚼性和回復性增加。當牡丹花蕊蛋白添加量為6%時，面團硬度、黏著性、咀嚼性比同量添加SPI分別高了20.73、17、42.93 g，說明與添加相同低量SPI相比，牡丹花蕊蛋白對提高面團特性效果較明顯，而彈性、內聚性、回復性與SPI相比差距不大。彈性和內聚性逐漸降低，尤其是添加量超過6%時，加入花蕊蛋白的面團彈性下降較明顯，導致下降的原因可能是添加蛋白限制了麥谷蛋白間二硫鍵的連接，使面筋功能特性受到破壞，內部結構變得致密[13-15]。

表1 牡丹花蕊蛋白和SPI添加量對面團質構性質的影響Table 1 Effects of addition of peony stamen protein or SPI on texture properties of dough

2.2 面團動態流變學特性分析

如圖1、2所示，添加牡丹花蕊蛋白和SPI對面團流變學特性G’和G”的影響有相同規律，隨著蛋白添加量增加，G’和G”不斷上升。在相同頻率下，當蛋白添加量不超過6%時，牡丹花蕊蛋白對面團G’和G”的影響與大豆SPI對面團影響相接近，這與面團質構結果一致。原因可能是添加低量蛋白時，促進了面團中面筋蛋白相互作用生成新的交聯結構，面筋蛋白網狀結構加強，使面團呈現較好的黏彈性[16-17]。圖中隨著牡丹花蕊蛋白添加量的增加，tanδ先增加后減小，當取代量為4%時，tanδ達到最大值，說明面團的黏性越大，而添加SPI的面團，tanδ不斷減小。隨著頻率的不斷升高，圖1、2中的tanδ均呈先下降后上升的趨勢。這說明在低頻率下混合面團的黏彈性較好，隨著頻率的不斷增高，黏彈性比迅速增大，說明在高頻率下混合體系結構不穩定，相對更容易遭到破壞[18]。

圖1 牡丹花蕊蛋白對面團動態流變學特性的影響Fig.1 Effect of peony stamen protein on the dynamic rheological properties of dough

圖2 SPI對面團動態流變學特性的影響Fig.2 Effect of SPI on dynamic rheological properties of dough

2.3 面筋蛋白微觀結構觀察分析

從圖3、4可以看出，沒加蛋白質的面筋蛋白表面氣孔完整、光滑、連續性較好，孔洞數量較多且大小均勻，但是孔洞較淺，持氣能力較弱。隨著兩種蛋白添加量增加，面筋蛋白的氣孔直徑逐漸增加，氣孔數量多且孔洞加深。當蛋白添加量為6%時，與SPI面筋蛋白微觀結構相比，含花蕊蛋白的面筋蛋白氣孔數量多，洞壁較薄，連續性較好。這說明花蕊蛋白與面筋蛋白相互作用的能力大于SPI，使得麥醇溶蛋白通過非共價鍵和麥谷蛋白結合，促進面筋網絡結構的形成[19]。隨著添加量繼續增加，可以發現兩種面筋蛋白的有序性明顯減弱，與對照組相比較表面的光滑度和均勻度變差，孔徑變大、斷裂、孔洞壁變厚使面筋蛋白結構變得松散。尤其是牡丹花蕊蛋白的添加量達到10%時，面筋蛋白內部結構完全受到破壞，原因可能是添加的蛋白質吸水性較強，加入較多蛋白質會與面筋蛋白競相吸水，從而不利于面筋蛋白空間網絡結構的形成[20]，石長碩等[21]研究也證實了添加過量大豆蛋白會弱化谷朊粉中面筋蛋白的網絡結構，與本實驗研究結果一致。

圖3 牡丹花蕊蛋白添加量對面筋蛋白微觀結構的影響Fig.3 Effect of peony stamen protein on the microstructure of gluten proteins

圖4 SPI添加量對面筋蛋白微觀結構的影響Fig.4 Effect of SPI on the microstructure of gluten proteins

2.4 面筋蛋白二級結構分析

如圖5所示，在3100～3500 cm-1處有吸收帶，添加牡丹花蕊蛋白和SPI與對照組相比都發生了紅移，這是碳水化合物結合O—H伸縮振動吸收，與分子間氫鍵的連接相關[22]。從圖5可以看出，在2900～3000、1600～1700 cm-1和1510～1500 cm-1均出現了吸收峰，并且位置發生偏移，說明添加蛋白質對面筋蛋白產生影響，酰胺I帶（主要為C＝O的伸縮振動，1600～1700 cm-1）中包含α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲結構等信息，因此，常用來對蛋白質的二級結構進行解析[23]。從表2可以看出，當花蕊蛋白添加量為6%時α-螺旋相對含量達到了最大值，相比空白組增加了10.24%，而添加SPI的α-螺旋相對含量不斷增加，添加量為10%時比空白組增加了19.52%。β-折疊和β-轉角結構所占比例隨著牡丹花蕊蛋白添加量增加先減少后增加，而隨著SPI的增加呈現下降的趨勢，原因可能是蛋白質有很強的吸水性，使得體系中的自由水不斷減少，導致面筋蛋白中的氫鍵被破壞[24-25]。無規卷曲結構會使蛋白構象不穩定，花蕊蛋白的加入呈現無規律，SPI添加的面筋蛋白中含量在不斷上升，則說明添加過量蛋白會破壞面筋蛋白的網絡結構的穩定性。隨著蛋白添加量增加，含花蕊蛋白的面筋蛋白二級結構主要從β-轉角變成β-折疊，而加入SPI的面筋蛋白二級結構從β-折疊變成α-螺旋。花蕊蛋白和SPI添加量為6%時，α-螺旋＋β-折疊的占比達到最大值，分別為59.32%和61.95%，α-螺旋和β-折疊都是相對穩定的結構，有利于提高面制品的硬度和彈性[26]，這與前面研究面筋蛋白表面微觀結構結果一致。

圖5 不同牡丹花蕊蛋白和SPI添加量的面筋蛋白紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of gluten proteins added with different amounts of peony stamen protein or SPI

表2 牡丹花蕊蛋白和SPI添加量對面筋蛋白二級結構的影響Table 2 Effects of addition of peony stamen protein or SPI on the secondary structure of gluten proteins

2.5 面筋蛋白巰基和二硫鍵的測定分析

如表3所示，兩種蛋白對面筋蛋白二硫鍵影響基本一致，但SPI略好于牡丹花蕊蛋白。隨著添加量增加，游離巰基含量先下降后上升，而總巰基和二硫鍵含量呈現先增加后下降趨勢，這是因為二硫鍵和巰基可通過氧化還原實現相互轉化。當添加量為6%時，加入花蕊蛋白和SPI二硫鍵含量與對照組相比分別增加了1.98 μmol/g和3.24 μmol/g，添加適量蛋白質可促進面筋蛋白中的二硫鍵形成，維持空間結構的穩定性。二硫鍵會使蛋白質肽鍵間相互交聯，增加其機械強度和硬度，這可能是造成面團中硬度不斷增加的原因之一。加入過量蛋白時，二硫鍵含量減少，這可能也是導致面團彈性降低的主要因素之一，對應的游離巰基含量不斷增加，與添加6%時分別增加了2.84 μmol/g和1.75 μmol/g，花蕊蛋白影響較大的原因可能是還原性相比SPI較強，使游離巰基形成過多，但游離巰基會使面筋的網絡結構弱化，降低了面筋的網絡結構性[27-28]。整體來說，適量添加牡丹花蕊蛋白可維持面筋蛋白空間結構的穩定性。

表3 牡丹花蕊蛋白和SPI添加量對面筋蛋白巰基和二硫鍵含量的影響Table 3 Effects of addition of peony stamen protein or SPI on the contents of sulfhydryl and disulfide bonds in gluten proteins

3 結論

牡丹花蕊蛋白能夠明顯提高面團的硬度、黏著性和咀嚼性，添加量低于6%時效果優于SPI，而彈性、內聚性、回復性與SPI相比差距不大。流變性研究表明，添加蛋白提高了面團G’和G”，當花蕊蛋白添加量為4%時，面筋蛋白tanδ達到最大值，面團的黏性較大。低添加量花蕊蛋白和SPI混合面團都表現出較好的黏彈性。

掃描電鏡顯示，添加花蕊蛋白能夠改善面筋網絡結構，添加量為6%時網絡結構連續性最好，氣孔數量多且孔洞深，改善效果略好于SPI。添加花蕊蛋白和SPI能夠促使面筋蛋白穩定性差的β-轉角轉化為結構穩定的α-螺旋和β-折疊，添加量為6%時，α-螺旋＋β-折疊占比達到最大值，分別為59.32%和61.95%。花蕊蛋白添加量為6%時，面筋蛋二硫鍵含量達到最高，與空白組相比提高了89%，SPI對二硫鍵含量的影響略優于花蕊蛋白。