糖基化聯合磷酸化降低鰱魚小清蛋白致敏性的機制

陳文美，周厚澤，邵艷紅，劉 俊,*，涂宗財,2

（1.江西師范大學生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發專業中心，江西 南昌 330022；2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

魚類含有豐富的蛋白質和不飽和脂肪酸，是人類重要的食品原料，但魚類會引起過敏反應，嚴重威脅人類的健康[1]。魚類過敏是人體對魚體中抗原物質產生的不良反應，是八大食物過敏原之一[2]。而鰱魚是我國四大家魚之一，具有重要的經濟和食用價值，但鰱魚及其魚糜制品中主要過敏原小清蛋白（parvalbumin，PV）引起的過敏反應威脅著許多人的健康[3]，如何消減鰱魚PV的致敏性是食品安全領域急需解決的科學問題。

PV 是一種水溶性球狀蛋白，分子質量約為11～14 kDa，廣泛存在于低等脊椎動物的白色肉中，其在人體鈣生理學中起到至關重要的作用。很多魚類中存在2～5 種不同的PV亞型，它們均能與IgE結合，且PV聚合形成的二聚體或四聚體均有較強的IgE結合能力，在熱處理或極端pH值條件下仍保持過敏[4]。PV的致敏性取決于它所包含的抗原表位，有AA34-37、AA78-80、AA90-94和AA94-109。破壞抗原表位是目前一種有效降低PV致敏性的脫敏技術，如：熱處理、蛋白質修飾（糖基化、磷酸化等）、酶解和發酵法等方法被用來消減蛋白質的致敏性[5-8]，其中，蛋白質修飾技術是一種比較有前景的方法，能夠改善蛋白質的功能特性，同時也能有效降低其致敏性[9-10]。Zhao Yongjuan等[11]發現糖基化顯著降低了PV的IgG結合能力；Li Zheng等[12]發現PV-麥芽糖的IgE結合能力在美拉德反應后被顯著抑制；Li Canpeng等[13]利用磷酸化修飾也可以降低PV的致敏性。雖然單獨的磷酸化或糖基化可以在一定程度上降低PV的致敏性，但它并不能有效地將致敏性降低到滿意的程度。基于各種方法的優缺點，聯合2 種或2 種以上方法降低PV過敏性具有較好的應用前景，而糖基化聯合磷酸化修飾降低鰱魚PV致敏性的研究鮮有報道。

因此，本實驗以鰱魚PV為研究對象，選用半乳糖和焦磷酸鈉先后對其進行共價修飾，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electro-phoresis，SDS-PAGE）、圓二色譜和光譜等技術分析改性前后鰱魚PV多級結構的變化；運用高分辨質譜技術對糖基化聯合磷酸化修飾的鰱魚PV進行修飾肽段和位點表征；同時采用酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、嗜堿性粒細胞細胞系（KU812）模型評價糖基化聯合磷酸化修飾的鰱魚PV與IgG/IgE的結合能力以及對KU812細胞釋放組胺（histamine，HIS）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚購自江西省南昌市長勝市場，取背部白色肌肉立即實驗或保存于-80 ℃。

焦磷酸鈉、半乳糖 北京索萊寶科技有限公司；BeyoBlueTM考馬斯亮藍超快染色液 碧云天生物科技（上海）有限公司；人IL-6 ELISA試劑盒 北京四正柏生物科技有限公司；人HIS ELISA試劑盒 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；KU812細胞株 武漢普諾賽生命科技有限公司；淡水魚過敏患者血清 南昌大學第一附屬醫院；鼠血清 實驗室自制；山羊抗人IgE-辣根過氧化物酶 美國Sigma公司；山羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶 武漢三鷹生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FA1104N電子分析天平 上海丙林電子科技有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；Mini-Protean電泳儀 美國Bio-Rad公司；Synergy H1酶標儀 美國BioTek公司；SR160W二氧化碳培養箱 上海舍巖儀器有限公司；MOS 450圓二色譜儀 法國Bio-Logic公司；F-7000熒光光譜儀 日本Hitachi公司；Q-Exactive HF質譜儀、Acclaim PepMap 100納流預柱（100 μm i.d.，2 cm，C18，5 μm，100 ?）和Acclaim PepMap RSLC納流分析柱（C18，15 cm×2 μm，50 μm，100 ?） 美國賽默飛世爾科技公司；5430R冷凍離心機 德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參考前期報道的方法[3]，取新鮮鰱魚背部白色肌肉經煮沸和分級鹽析后，借助高效液相結合尺寸排阻色譜對鹽析后的PV進行分離純化。基于PV的分子質量和色譜的分布情況，收集經尺寸排阻色譜分離后第II～IV峰溶液，并對該溶液進行超濾除鹽、凍干，得到鰱魚PV。將其溶于純水中，調整其質量濃度為1.0 mg/mL。將20 mg半乳糖溶解在20 mL 1.0 mg/mL鰱魚PV溶液中，凍干成粉末，然后在60 ℃、65%相對濕度下孵育2 h，冰上放置20 min終止反應。磷酸化反應條件與糖基化反應條件相同。反應結束后使用3 kDa超濾離心管除去未反應的糖和鹽，-20 ℃保存備用。鰱魚PV通過半乳糖修飾，未結合的半乳糖通過超濾去除，收集濃縮液，凍干成粉末，用純水溶解后加與鰱魚PV同質量的焦磷酸鈉混勻后進行凍干，以凍干粉的形式進行磷酸化反應即為糖基化聯合磷酸化反應，該復合反應與上述糖基化和磷酸化反應條件相同。未經處理的鰱魚PV命名為N-PV。干熱處理，不添加試劑，與糖基化聯合磷酸化反應條件相同的樣品命名為H-PV。通過糖基化、磷酸化和糖基化聯合磷酸化修飾的樣品分別命名為Gal-PV、SP-PV和Gal-SP-PV。

1.3.2 分子質量測定

參照Liu Jun等[14]方法使用SDS-PAGE分析樣品的分子質量變化。樣品質量濃度為1 mg/mL，上樣量為10 μL，分子質量標記物為10～180 kDa。凝膠電泳結束，用考馬斯亮藍快速染色液進行染色，最后用水脫色，背景清晰透明。

1.3.3 游離氨基含量測定

使用鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）方法測定樣品中的游離氨基含量，參照Wang Zhongjiang等[15]方法并適當修改。取100 μL樣品溶液加入到2 mL OPA溶液中混勻，100 μL蒸餾水代替樣品作為空白對照，在37 ℃避光反應2 min后，使用酶標儀在波長340 nm條件下測其吸光度。

1.3.4 二級結構的測定

參照Zhang Ming等[16]的方法進行測定。設定參數為：光譜掃描范圍190～250 nm，掃描速率60 nm/min，狹縫寬度1 nm。

1.3.5 內源熒光的測定

根據Zhao Chengbin等[17]的方法并適當修改。將待測樣品稀釋至1 mg/mL，測定條件為：激發波長為290 nm，發射光譜為200～500 nm，狹縫寬度5 nm，掃描速率1200 nm/min。

1.3.6 高效液相色譜結合質譜鑒定修飾肽段和位點

采用Nano-LC-ESI-QOrbitrap-MS/MS對Gal-PV、SP-PV和Gal-SP-PV的修飾位點和肽段進行鑒定，并進行修改[18]。流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為0.1%甲酸-乙腈溶液，采用逐步梯度洗脫的方法進行洗脫[18]，流速為220 nL/min。采用正離子模式，一級母離子的質量掃描范圍m/z250～1250。根據質譜信號強度選擇前20 個肽段進行破碎，破碎模式為高能碰撞解離，能量為27%。母離子圖譜用Xcalibur軟件分析，對肽段序列分析用PEAKS軟件完成。

1.3.7 IgG/IgE結合能力測定

參考Ma Jiaju等[19]方法并略作調整，通過間接ELISA測定的N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的IgE結合能力。一抗為4 名對淡水魚過敏患者的血清組成，山羊抗人IgE-辣根過氧化物酶為二抗，稀釋度均為1∶100。通過Zhang Min等[20]使用間接競爭ELISA測定鰱魚PV樣品的IgG結合能力，并于波長450 nm處測定吸光度，以半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為指標。實驗所需的一抗為實驗室自制的小鼠抗鰱魚PV血清組成，稀釋度為1∶3200，山羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶為二抗，稀釋度均為1∶2000。IgG結合力的抑制率按下式計算：

式中：B與B0分別為添加樣品后的吸光度、未添加抗原的陽性對照吸光度。

1.3.8 人嗜堿性粒細胞（KU812）脫顆粒實驗

KU812細胞采用RPMI-1640培養基，含10%胎牛血清和1×105U/L青霉素/鏈霉素，于37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養。將含有2×106個KU812細胞接種于24 孔板中24 h，用10 μL魚過敏患者的混合血清被動激活24 h，然后用50 μL/孔1 mg/mL樣品刺激4 h。以磷酸鹽緩沖液處理的細胞作為陰性對照。采用ELISA分析HIS和IL-6的釋放情況，并按照生產商的說明進行分析。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 分子質量

將收集得到的蛋白上清液（第II～IV峰的溶液）通過SDS-PAGE測定后，發現其分子質量大于10 kDa，這與PV的理論分子質量較為一致，且未見其他明顯蛋白條帶。結果表明，經煮沸和分級鹽析后的溶液經高效液相色譜結合尺寸排阻色譜純化后，上清液中的蛋白溶液即為PV（N-PV），因此將其進行后續的實驗。如圖1所示，與N-PV相比，H-PV的蛋白質條帶沒有發生明顯變化，而Gal-PV、SP-PV和Gal-SP-PV的條帶發生向上遷移，尤其是Gal-SP-PV條帶向上遷移最為明顯。該結果表明鰱魚PV與半乳糖和磷酸基團共價交聯形成高分子質量物質，導致蛋白條帶向上遷移。

圖1 N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的電泳圖Fig.1 Eelectrophoretograms of N-PV,Gal-PV,SP-PV,Gal-SP-PV and H-PV

2.2 游離氨基含量

糖基化和磷酸化反應可發生在蛋白質特定的位點上，例如賴氨酸、絲氨酸、精氨酸和N-端的游離氨基等[21-22]，使蛋白質的游離氨基含量降低，因此通過測定游離氨基的含量能夠進一步確定鰱魚PV是否發生糖基化和磷酸化反應。如圖2所示，與N-PV相比，H-PV的游離氨基含量改變不顯著，而SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的游離氨基含量顯著降低（P＜0.05）。結果表明，鰱魚PV發生糖基化和磷酸化。此外，Gal-SP-PV的游離氨基含量最低，其次是Gal-PV和SP-PV，這是由于更多氨基酸被糖基化和磷酸化修飾。

圖2 N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的游離氨基含量Fig.2 Free amino contents of N-PV,Gal-PV,SP-PV,Gal-SP-PV and H-PV

2.3 二級結構

如表1所示，N-PV的二級結構中，α-螺旋相對含量為57.29%，β-折疊相對含量為7.78%，β-轉角相對含量為12.48%，無規卷曲相對含量為22.46%。與N-PV相比，H-PV的α-螺旋和β-轉角的相對含量比例較高，分別為60.45%和17.97%，而β-折疊和無規卷曲的比例較低。有研究表明α-螺旋含量的增加主要由β-折疊的降低引起[23]。結果表明，長時間加熱會在一定程度上破壞鰱魚PV的氫鍵網絡，引起蛋白質多肽鏈的部分擴張。此外，在SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV中，α-螺旋的比例呈不斷下降趨勢（P＜0.05），而β-折疊和β-轉角的相對含量比例呈現相反的趨勢。該結果表明，糖基化聯合磷酸化修飾的鰱魚PV二級結構相對含量發生明顯改變，主要表現為α-螺旋相對含量的降低和β-折疊相對含量的增加。蛋白質的二級結構靠氨基酸序列和分子內不同區域的相互作用而維持[24]，而糖基化聯合磷酸化會明顯破壞這些相互作用，從而導致PV的二級結構發生變化。相似的結果也被Sun Yuanxia等[25]報道，卵清蛋白經美拉德反應后α-螺旋相對含量減少，β-折疊稍有增加；Rupa等[26]報卵清蛋白α-螺旋相對含量的減少會抑制其過敏反應。此外，有研究報道PV內部含有較多的α-螺旋[27]，根據表1數據可發現其占據二級結構的57.29%，PV的過敏表位大概率分布在這些α-螺旋上，因此α-螺旋結構的破壞可能會在一定程度上降低PV與特異性抗體的親和力，從而降低其致敏性。

表1 N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的二級結構相對含量變化Table 1 Changes in secondary structure contents of N-PV,Gal-PV,SP-PV,Gal-SP-PV and H-PV %

2.4 內源熒光強度

熒光強度的變化可用于分析N-PV、Gal-PV、SPPV、Gal-SP-PV和H-PV的構象變化。如圖3所示，與N-PV相比，H-PV的熒光強度降低，而SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的熒光強度顯著降低，降低程度為SP-PV＜Gal-PV＜Gal-SP-PV。熒光強度的降低可能是由于蛋白質與還原糖和磷酸基團的接入使PV的色氨酸區域被屏蔽[28]，從而導致其產物的熒光強度降低。結果表明，PV經磷酸化、糖基化和糖基化聯合磷酸化修飾后空間結構被破壞，破壞的程度為糖基化聯合磷酸化＞糖基化＞磷酸化。當PV發生美拉德反應后，賴氨酸或精氨酸的氨基與還原糖發生反應，其二級結構或三級結構發生改變，從而影響了抗原表位的結合活性[29]；劉俊等[30]也報道經糖基化、磷酸化和乙酰化修飾的α-乳白蛋白的三級結構和分子質量的變化與其致敏性有關。因此，PV三級結構的改變也是影響其免疫活性的重要原因。

圖3 N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的熒光強度Fig.3 Fluorescence intensity of N-PV,Gal-PV,SP-PV,Gal-SP-PV and H-PV

2.5 糖基化和磷酸化修飾位點

為了更好地闡明糖基化聯合磷酸化修飾對鰱魚PV一級結構的影響，采用質譜對SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的修飾位點的數量和位置進行鑒定，結果如圖4和表2所示。圖4a、c顯示77ALTDAETKAFLK88和29SFFAKVGLSAK39的m/z分別為735.39242＋和658.85953＋。通過b和y離子值之間差值（圖4b、d），可以確定多肽77～88和29～39氨基酸序列中的修飾位點分別為K84和K33（表2）。類似地，通過相同的糖基化方法鑒定了SPPV、Gal-PV和Gal-SP-PV上的修飾位點。如表2可知，Gal-PV含有8 個修飾位點，分別為K33、K46、K55、K65、K84、K88、K97和K108。在SP-PV中發現了2 個磷酸化位點（S56和S92）。其中，Gal-SP-PV具有與Gal-PV相同的8 個糖基化位點外，還含有一個與SP-PV相同的磷酸化位點（S56）。結果表明，糖基化聯合磷酸化修飾的鰱魚PV含有最多的修飾位點。

圖4 SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的修飾位點質譜測定Fig.4 Mass spectra showing modification sites of SP-PV,Gal-PV and Gal-SP-PV

表2 高效液相色譜-質譜鑒定修飾肽段和位點Table 2 Modified peptides and sites identified by high performance liquid chromatography-mass spectrometry

2.6 IgG/IgE結合能力

圖5a顯示了鰱魚PV的IgG結合能力。H-PV的IC50值為14.3 μg/mL，遠低于N-PV（40.6 μg/mL），而SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的IC50值分別為43.8、55.6 μg/mL和76.9 μg/mL。圖5b為鰱魚PV的IgE結合能力，可觀察到與IgG結合能力類似的趨勢。同一樣品與不同患者血清的IgE結合能力存在一定差異，但總體而言，H-PV的吸光度高于N-PV，而SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的吸光度低于N-PV。如圖5b所示，鰱魚PV的IgE結合能力在加熱后顯著增強（P＜0.05），而經糖基化、磷酸化和糖基化聯合磷酸化修飾后，IgE結合能力下降，下降趨勢為SP-PV＜Gal-PV＜Gal-SP-PV。這些結果表明，糖基化聯合磷酸化修飾能夠降低鰱魚PV的IgG/IgE結合能力。

圖5 N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的IgG（a）、IgE（b）結合能力Fig.5 IgG (a) and IgE (b) binding capacity of N-PV,Gal-PV,SP-PV,Gal-SP-PV and H-PV

2.7 KU812細胞

嗜堿性粒細胞的脫顆粒率是決定過敏原免疫反應性的關鍵因素。如圖6所示，與對照組比，N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的HIS和IL-6含量增加，說明鰱魚PV的添加影響過敏癥狀相關介質的釋放。與N-PV相比，Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV的HIS和IL-6釋放量低，其中Gal-SP-PV的釋放量顯著低于N-PV（P＜0.05）。可能的原因是糖基化聯合磷酸化修飾的鰱魚PV誘導嗜堿性粒細胞脫顆粒的程度較弱，減弱了效應細胞分泌HIS等生物活性介質能力，而炎癥性介質會在一定程度上引起以毛細血管擴張、平滑肌收縮等為特點的病理變化，從而誘發身體局部或全身過敏反應[31]。這與圖5結果一致。結果表明，糖基化聯合磷酸化修飾的鰱魚PV降低KU812細胞HIS和IL-6分泌，降低其過敏反應。

圖6 N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV對KU812細胞釋放HIS（a）和IL-6（b）能力的影響Fig.6 Effects of N-PV,Gal-PV,SP-PV,Gal-SP-PV和H-PV on release of HIS (a) and IL-6（b）from KU812 cells

2.8 糖基化聯合磷酸化修飾降低PV致敏性的機制分析

PV是鰱魚及其魚糜制品中的主要過敏原，如何降低其致敏性具有重要的意義。通過各種物理和化學方法破壞過敏蛋白的抗原表位降低其致敏性是目前行之有效的脫敏技術[6]。本研究中選用半乳糖和焦磷酸鈉先后對鰱魚PV進行共價修飾，與單獨Gal-PV和SP-PV相比，糖基化聯合磷酸化修飾能顯著降低其致敏性，如IgG和IgE結合能力的降低（圖5）、KU812細胞中HIS和IL-6含量的減少（圖6）。

蛋白質的抗原表位是引起其過敏反應的結構基礎，過敏蛋白致敏性的降低與其抗原表位的破壞有關，而抗原表位分為線性表位和構象性表位，經不同物理和化學方法處理后，會引起線性表位或構象表位的變化。本研究中，與單獨糖基化和磷酸化相比，半乳糖和磷酸基團先后與鰱魚PV共價結合可以增加其分子質量（圖1），顯著降低游離氨基含量（圖2），改變二級結構（表1）和構象結構（圖3），這些結構的變化會破壞鰱魚PV的構象過敏表位，從而降低其致敏性。如圖7所示，糖基化聯合磷酸化修飾的PV不僅含有與Gal-PV相同的8 個糖基化位點（K33、K46、K55、K65、K84、K88、K97和K108），還包含1 個與SP-PV相同的磷酸化位點S56。Zhao Yongjuan等[11]發現PV的抗原表位為AA34-37，AA78-80和AA88-93和AA94-109，而糖基化位點（K88、K97和K108）和磷酸化位點（S92）位于PV的線性表位區域，這些糖基化位點和磷酸化位點能遮掩PV的線性表位，降低其致敏性。雖然K33、K46、K55、K65和K84不在PV的抗原表位區域，但其與共價結合的糖鏈會形成一定的空間位阻，降低PV與IgG/IgE的結合能力。因此，PV致敏性的降低取決于糖基化位點聯合磷酸化位點遮掩其線性表位和破壞其構象表位。

圖7 糖基化和磷酸化修飾的PV帶狀圖Fig.7 Ribbon diagram of glycated and phosphorylated PV

3 結論

綜上所述，與單一的糖基化或磷酸化修飾相比，糖基化聯合磷酸化修飾能夠顯著降低鰱魚PV的致敏性。糖基化聯合磷酸化修飾能增加鰱魚PV的分子質量和糖基化修飾位點，而游離氨基含量和內源熒光吸收強度顯著減少，這些結果表明糖基化聯合磷酸化修飾能顯著改變鰱魚PV的抗原表位；同時糖基化聯合磷酸化修飾降低了鰱魚PV與IgE/IgG的結合能力以及對KU812細胞脫顆粒（HIS和IL-6）的釋放能力。這說明糖基化聯合磷酸化修飾通過破壞鰱魚PV的抗原表位，降低IgG/IgE的結合能力和KU812細胞的過敏反應，但致敏性的評價并不全面，需要更多的實驗（如動物和臨床實驗等）驗證其效果。