多效唑納米微球懸浮液的制備及性質研究

石文慧，王曉艷，李世卿，侯福鼎，張小軍，李姝靜

(1.北京工商大學 化學與材料工程學院，北京 100048；2.福建諾德生物科技有限責任公司，福建 三明 365300; 3.中農立華生物科技股份有限公司，北京 100052)

農藥在現代農業的作物生長管理中發揮著重要作用［1］。然而，由于飄移、被雨水沖刷到環境中，傳統配方的農藥有效利用率不到1%［2-3］。為了達到更好的防治效果，農藥不得不超量使用，這對田間生態系統和人體健康造成了威脅。與傳統農藥劑型相比，納米農藥可以增強農藥在作物葉片表面的附著力和鋪展性，提高利用率，同時降低環境污染風險。因此，開發一種具有鋪展性的緩釋納米農藥是提高農藥利用率的一種很有前景的方法［4-5］。

玉米醇溶蛋白(zein)具有兩親性質，生物相容性好，安全無毒［6］。由于擁有多肽結構，還具有易降解的優點，對環境友好。此外，玉米醇溶蛋白在醇的水溶液中可以自組裝形成納米微球，包埋疏水性分子實現可控釋放，是傳遞物質的理想載體［7］。但是玉米醇溶蛋白中疏水基團較多，水溶性較差，難以提高負載分子的利用率。

殼聚糖(chitosan，CS)是地球上最常見的豐富的天然多糖，主要來源為甲殼類動物的外部骨骼以及某些細菌和真菌的細胞壁中提取的幾丁質脫乙酰化產生［8］。殼聚糖具有優異的生物官能性、生物相容性、無毒、抗菌性和生物降解性［9］，是食品、藥品、生化和農業領域合成控釋系統的首選材料。有研究表明，殼聚糖是玉米醇溶蛋白微球的一種優良的穩定劑，可提高微球的穩定性［10］。

多效唑(paclobutrazol，PBZ)是一種高效低毒的植物生長調節劑，屬于含氮雜環化合物中的三唑類化合物［11］。多效唑能夠延緩植物生長，抑制莖的伸長，延緩植物衰老等生理效應［12］，但是多效唑微溶于水，實際使用率低，限制了其應用。

由于具有清潔、高效和環保的優點，靜電自組裝是制備納米材料的重要方法。Zein 與CS 之間存在氫鍵、靜電等相互作用力。靜電自組裝是將2 個帶有相反電荷的聚電解質，通過靜電相互作用，以吸附的方式形成納米級微球，所形成的微球具有結合強度高、穩定等優點。Zein 具有較高的負電荷密度，可以在自組裝過程中提供陰離子組分，而CS作為一種陽離子聚電解質，能夠通過靜電、氫鍵、疏水等作用力與zein 形成納米微球。在本研究中，zein 是PBZ 的載體，無水碳酸鈉為犧牲模板，當zein-無水碳酸鈉乙醇溶液加入水中時，無水碳酸鈉擴散，通過反溶劑沉淀形成zein 納米微球，PBZ 可以由無水碳酸鈉留下的通道進入zein，CS 以靜電自組裝的方法與zein 結合，形成負載多效唑的納米微球。因此，本研究通過靜電自組裝制備了負載多效唑的殼聚糖/玉米醇溶蛋白納米微球(CS/zein-PBZ)后，考察了CS 與zein 質量比對空白納米微球以及載多效唑納米微球的粒徑、多分散指數(PDI)和zeta 電位的影響，以及對比了不同殼聚糖和玉米醇溶蛋白質量比和不同殼聚糖濃度下的載藥量，表征了多效唑納米微球的結構、穩定性和緩釋性能，以期揭示其釋放機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖(摩爾質量為1.15×106g/mol，脫乙酰度為81.63%，阿拉丁有限公司)；玉米醇溶蛋白(92%，上海源葉生物有限公司)；多效唑(摩爾質量為291.78 g/mol，上海源葉生物有限公司)；15%多效唑可濕性粉劑(市售)；無水碳酸鈉(分析純，麥克林有限公司)；無水乙醇(分析純，GENERAL-REAGENT)；冰乙酸、甲醇、磷酸鹽緩沖液［分析純，福晨(天津)化學試劑有限公司］。

1.2 設備與儀器

N-1100V-W(WD)旋轉蒸發儀(東京理化器械株式會社)；C-MAG HS 7 磁力攪拌器(德國IKA 公司)；JSM 6700F 掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社)；Cary-50UV-vis 紫外可見分光光度計(美國Varian 公司)；Zetasizer Nano ZS90 粒徑分析儀(英國Malvem 公司)；DSA-100 接觸角測試儀(德國KRUSS 公司)；UltiMate3000高效液相色譜(中國賽默飛世爾科技公司)。

1.3 方法

1.3.1 CS/zein 納米微球的制備

參照Khan 等［13］的方法制備了CS/zein 空白納米微球。稱取0.5 g 的玉米醇溶蛋白粉末溶于10 mL 70%的乙醇水溶液中，配制成質量濃度為5% 的玉米醇溶蛋白溶液。稱取0.1 g 的無水碳酸鈉溶于10 mL的去離子水，配制成質量濃度為1% 的無水碳酸鈉溶液。將1 mL 5%的玉米醇溶蛋白溶液加入到0.3 mL無水碳酸鈉與0.7 mL 無水乙醇的混合液中，再將玉米醇溶蛋白和無水碳酸鈉混合液逐滴加到8 mL 去離子水中，持續攪拌10 min 后，分別逐滴滴加到10 mL殼聚糖質量濃度為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1% 的1%乙酸溶液中，室溫下攪拌30 min，得到CS/zein 納米微球。

1.3.2 CS/zein-PBZ 納米微球的制備

分別稱取5、10、15、20 mg 的多效唑溶于1 mL 5%的玉米醇溶蛋白溶液，加入到0.3 mL 無水碳酸鈉溶液和0.7 mL 無水乙醇混合液中。然后逐滴滴加到8 mL 去離子水中，持續攪拌10 min 后，滴加到0.02%~0.1%的殼聚糖溶液中，室溫攪拌30 min，得到CS/zein-PBZ 納米微球懸浮液。

1.3.3 SEM 觀察

將試樣進行稀釋，滴在處理好的硅片上，在室溫中干燥8 h，表面作噴金處理后，放入電鏡室以觀察試樣形貌，加速電壓是5.0 kV。用Nano Measurer 1.2 軟件標注納米微球的直徑后，統計計算微球的直徑分布圖。

1.3.4 動態光散射(DLS)

用散射角為90°的Zetasizer Nano ZS90，在25 ℃下通過動態光散射測量微球大小、多分散指數和zeta 電位。

1.3.5 標準曲線的繪制

準確稱取適量多效唑，定容后在200~800 nm 波長范圍內對試樣進行紫外掃描，考察試樣的紫外吸收情況，以最大吸收波長為多效唑的檢測波長。色譜柱為Venusil MP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.3%(質量分數)磷酸鹽緩沖液(pH=3，90∶10)。檢測波長267 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。將試樣分別稀釋至不同濃度，按照所述的色譜條件進樣，記錄相應的峰面積。以進樣濃度為橫坐標，PBZ 峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到PBZ 標準曲線。

1.3.6 包埋率和載藥量

包埋率(encapsulation efficiency)是指多效唑納米微球中包裹多效唑的質量與多效唑的投入量的比，載藥量(loading efficiency)是指多效唑占多效唑納米微球的比重。將制備好的試樣用離心機在6 000 r/min 下離心10 min，取上清液通過高效液相色譜法得到多效唑含量。通過標準曲線計算多效唑的濃度，根據公式⑴、⑵計算包埋率和載藥量。

2 結果與分析

1.3.7 接觸角

室溫下，用接觸角測試儀測定了多效唑可濕性粉劑懸浮液和多效唑納米微球懸浮液的潤濕性能。將稀釋一定倍數的試樣滴在Parafilm 載玻片上。液滴形態的變化被數字化捕捉5 min，每個試樣測試3 次，使用五點擬合分析法計算了左右側接觸角的平均值。

1.3.8 緩釋性能研究

通過透析袋法［14］研究了納米微球中多效唑的緩釋性能，釋放介質為乙醇/水(1∶1，體積比)。將具有相同有效含量的多效唑試樣連同釋放介質一起轉移到透析袋(MWCO，500D)中，將透析袋放入裝有釋放介質的燒杯中。在特定的時間間隔內，收集3 mL試樣，并迅速用相同體積的新鮮釋放介質代替，用紫外可見分光光度計測量吸光度3 次。多效唑的累積釋放率通過公式⑶計算：

式中：Ct為在t時取出的試樣濃度，mg/mL；Vt-1(3 mL)為在t-1 時取出的試樣體積；V(100 mL)為初始溶液體積；w為透析袋中多效唑的質量，mg。

2.1 DLS 和儲存穩定性

如圖1 所示，當溶液中玉米醇溶蛋白的含量不變時，殼聚糖的濃度增加，CS/zein 納米微球的粒徑也隨之增加，這可能是因為能夠包裹玉米醇溶蛋白的殼聚糖的量增加，從而導致粒徑有所增加。PDI可以用來證明納米微球的均一性，其數值越小代表試樣的均一性越好。PDI 的數值均在0.3 以下，表明CS/zein 納米微球具有良好的分散性。當zeta 電位的絕對值大于30 mV 時，可認為納米微球的體系是具有一定穩定性的，絕對值越大，體系的穩定性越高。CS/zein 納米微球的zeta 電位均大于65 mV，表明體系具有較高的穩定性。在熱貯(54 ℃)條件下儲存了14 d 后，微球粒徑沒有明顯變化，PDI 小于0.3，表明微球具有一定的儲存穩定性。隨著殼聚糖的加入量增加，體系依舊能夠保持良好的穩定性，CS/zein納米微球的粒徑基本保持不變。這是由于CS 具有高電荷密度，當CS 的加入量逐漸增加時，CS 能與帶負電荷的zein 緊密交聯。此外，納米微球由于CS的加入所帶有的正電荷與游離的CS 之間存在靜電排斥，靜電斥力的存在可以防止納米微球過度團聚形成沉淀，對溶液的穩定性有積極的影響。

圖1 殼聚糖的濃度對CS/zein 納米微球的粒徑(A)、PDI(B)和zeta 電位(C)的影響

如圖2 所示，CS/zein-PBZ 納米微球，在加入了不同質量的多效唑后，平均粒徑也隨之變化，與CS/zein 納米微球相比，PDI 的值也有所增加，這說明多效唑的加入會影響納米微球的顆粒大小和體系的均一性，同樣具有較高的zeta 電位，說明加入多效唑以后，納米微球也具有很好的穩定性。

圖2 殼聚糖的濃度對CS/zein-PBZ 納米微球的粒徑(A)、PDI(B)和zeta 電位(C)的影響

如圖3 所示，當多效唑的投入量分別為5、10、15、20 mg 時，CS/zein-PBZ 納米微球的粒徑都隨著殼聚糖濃度的增加而增加，在熱貯(54 ℃)條件下經過14 d 保存以后，其粒徑的變化不大，說明此方法制備的CS/zein-PBZ 納米微球具有良好的穩定性。此外，都具有較低的多分散性，當多效唑的投入量為20 mg 時，納米微球的PDI 都在0.3 以下，說明多效唑在此濃度下的納米微球均一性最好。

圖3 CS/zein-PBZ 納米微球的粒徑與PDI 隨殼聚糖濃度和儲存時間的變化

2.2 多效唑的包埋率和載藥量

如圖4 所示，當投入多效唑的質量為5 mg 時，包埋率隨殼聚糖的濃度總體上呈先減小后增大的趨勢，投入多效唑的質量為10、15、20 mg 時，包埋率隨殼聚糖的濃度呈增大的趨勢。殼聚糖濃度為0.1%時，多效唑的包埋率均高于同等質量多效唑其他殼聚糖濃度的，且在多效唑為20 mg 時達到最高，為89.9%，說明此時對多效唑的包埋效果最好。多效唑的包埋率和載藥量均隨著多效唑濃度的增加而增加，與包埋率不同的是，隨著殼聚糖濃度的增加，載藥量整體呈下降的趨勢。

圖4 CS/zein-PBZ 納米微球的包埋率(A)和載藥量(B)隨殼聚糖濃度的變化

在多效唑為20 mg 時CS/zein-PBZ 納米微球均具有較高的載藥量，殼聚糖濃度為0.1%時達到最大。考慮到納米微球的穩定性和均一性，殼聚糖的濃度為0.1%，多效唑為20 mg 時的CS/zein-PBZ 納米微球具有最優的表現，包埋率和載藥量分別為89.9%和28.8%，因此選用此納米微球進行后續的表征。

2.3 納米粒子的形態學觀察

如圖5 所示，CS/zein 納米微球和CS/zein-PBZ納米微球的掃描電子顯微鏡圖像呈球形，微球表面光滑，多效唑的加入并沒有改變CS/zein NPs 的形態。CS/zein 和CS/zein-PBZ 納米微球的平均粒徑分別是(186.94±46.16)、(175.69±33.22)nm，這一結果小于通過激光粒度儀所測得的平均粒徑。這可能是因為激光粒度儀是在溶液中測量微球的粒徑，這種情況下測得的是水合粒徑，而掃描電子顯微鏡的數據是在試樣被自然風干以后得到的，因此小于激光粒度儀所測得的納米微球的粒徑。這一結果與李等［15］報道的負載姜黃素的玉米醇溶蛋白-殼聚糖納米微球的結果類似。

圖5 CS/zein 納米微球(A、B)和CS/zein-PBZ 納米微球(C、D)的掃描電子顯微鏡圖和粒徑分布圖

2.4 多效唑的鋪展性能研究

良好的鋪展性可以減少液滴的滑落，有效降低農藥的損失。其鋪展性能可以由液滴的靜態接觸角大小來反映。如圖6 所示，多效唑可濕性粉劑和CS/zein-PBZ 納米微球懸浮液的接觸角分別為68.3°±2.36°和60.2°±2.22°。在多效唑有效含量相同的情況下，與多效唑可濕性粉劑直接分散到水中相比，經過玉米醇溶蛋白和殼聚糖包裹的多效唑納米微球懸浮液具有更好的鋪展性，證明了所制備的CS/zein-PBZ 納米微球可以提高多效唑的潤濕性。

圖6 PBZ WP 和CS/zein-PBZ 納米微球的接觸角

2.5 多效唑的釋放性能研究

具有緩釋性的農藥可以減少農藥用量，提高施用效率，解決農藥的過度使用問題，減少環境污染。因此，探究了CS/zein-PBZ 納米微球的釋放性能，選用殼聚糖濃度為0.1%，多效唑為20 mg 時的CS/zein-PBZ 納米微球試樣，該試樣的包埋率和載藥量分別為89.9%和28.8%。多效唑可濕性粉劑和CS/zein-PBZ 納米微球的釋放如圖7 所示，游離的多效唑在前4 h 保持較高的釋放速率，在12 h 釋放完成。而CS/zein-PBZ 納米微球在前12 h 處于快速釋放階段，這可能是由于藥物溶解并從聚合物的孔隙中擴散所致。12 h 后的延遲釋放階段可能是由于聚合物的降解。與游離多效唑相比，CS/zein-PBZ 具有明顯的緩釋特性。對一級動力學方程和Higuchi 動力學方程進行了模擬，得到了相應的擬合系數。很明顯，多效唑釋放曲線與一級動力學方程相吻合，R2值大于0.99(R12、R22分別代表PBZ和CS/zein-PBZ的釋放動力學方程中回歸平方和與總離差平方和的比值，比例越接近1，回歸擬合效果越好)，表明藥物濃度隨時間的增加而增加。

圖7 PBZ WP 和CS/zein-PBZ 納米微球的累積釋放曲線和動力學方程

3 結 論

基于殼聚糖與玉米醇溶蛋白靜電相互作用包裹多效唑構建了復合納米微球CS/zein-PBZ NPs 懸浮液，平均粒徑為(187±46)nm，具有較好的尺寸分布，以及較高的zeta 正電位(65 mV)。殼聚糖的濃度為0.1%，多效唑為20 mg 時，CS/zein-PBZ 納米微球的包埋率和載藥量達到最高，分別為89.9%和28.8%。在鋪展性方面，其靜態接觸角為60.2°±2.22°，小于多效唑可濕性粉劑的接觸角(68.3°±7.33°)，在釋放性能研究中，多效唑的釋放符合一級動力學方程，且R2值大于0.99。這些都證實了所制備的CS/zein-PBZ納米微球具有優良的理化性質，鋪展性以及緩釋性能。