食用農產品中主要生物毒素檢測技術研究進展

朱 川

（巴東縣公共檢驗檢測中心，湖北巴東 444300）

食用農產品是可供食用的各種植物、畜牧、漁業產品及初級加工產品，主要包括糧食類的谷類、豆類、薯類及對糧食進行淘洗、脫殼、分裝等加工處理的初級加工品；面皮，餃子皮米粉等糧食復制品；各類蔬菜及蔬菜經過晾曬、冷凍、脫水等工序加工的蔬菜，各類干菜、腌菜、咸菜等。

生物毒素是一類天然毒素，是生物體分泌的天然有毒物質，種類繁多，生物類型復雜，按照來源可以分為植物毒素、動物毒素、微生物毒素和海洋毒素。生物毒素種類繁多且結構復雜，有很多毒素目前尚未被發現，對于已發現的毒素，研究人員對其組成結構和功能的認識還處于初級階段，所以對生物毒素領域展開深入研究意義重大[1]。目前食用農產品中納入國家抽檢監測計劃的生物毒素主要有玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、曲霉毒素M1、展青霉素等。本文結合日常檢測及風險預測實際，主要針對玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉毒素和赭曲霉毒素的研究進展進行綜述。

1 玉米赤霉烯酮

目前食用農產品中玉米赤霉烯酮的檢測方法可以分為常規檢測方法和快速檢測技術。

1.1 常規檢測方法

我國國家標準對食品中玉米赤霉烯酮的測定常使用熒光光度法、液相色譜法、液相色譜-質譜法。熒光光度法是用乙腈溶液提取試樣中的玉米赤霉烯酮，經過免疫親和柱凈化后，加入氯化鋁溶液進行衍生，洗脫液通過熒光光度計測定。液相色譜法是用乙腈溶液提取試樣中的玉米赤霉烯酮，經過免疫親和柱凈化后，用高效液相色譜熒光檢測器測定，外標法定量。液相色譜質譜法原理是樣品用β-葡萄糖苷酸/硫酸酯復合酶水解后，用乙醚提取。經過液液分配，固相萃取柱凈化后，用液相色譜-質譜測定，外標法定量。此類常規檢測方法適用性廣，準確度也較高，但前處理時間較長。

1.2 快速檢測技術

邢廣旭等[2]開發了玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析快速檢測方法，用活潑酯法標記熒光單克隆抗體，制備了玉米赤霉烯酮熒光免疫試紙，用玉米樣品加標回收，回收率為86.4%～108.5%，檢測限可以達到1.2 ng·mL-1。還有一種基于痕量檢測的快速檢測技術適合初級加工食用農產品中痕量玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）的檢測，如謝子奇[3]等以Fe3O4@SiO2-MPS為磁性載體，制備了玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）磁性分子印跡聚合物（ZEN-MMIPs），該 研 究 以Fe3O4@SiO2-MPS為磁性載體，替代分子采用姜黃素，采用表面分子印跡技術制備了玉米赤霉烯酮磁性分子印跡聚合物（ZEN-MMIPs）。使 用 掃 描 電 鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）、傅 立 葉 紅 外 光 譜（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FTIR）、透 射 電鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）等技術對制備的磁性分子印跡納米微球進行表征，研究以ZEN-MMIPs為磁性分散固相萃取劑，結合高效液相 色 譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）完成了復雜食品基質中ZEN加標樣品的痕量檢測，相對標準偏差為2.11%，玉米汁樣品加標回收率為88.3%～94.7%，其建立的方法可用于復雜基質樣品中ZEN殘留的檢測。

結合新型材料的研究，ZEN的快速檢測技術也有了進一步提升。有研究以量子點（Quantum Dots，QDs）為標記材料，以ZEN單克隆抗體制備熒光免疫探針，標記試紙，以ZEN-BSA為檢測線，建立ZEN的熒光免疫層析試紙檢測技術。方法檢測限可以達到1.2 ng·mL-1；交叉反應率較低，與常見真菌毒均無交叉反應；回收率準確度較常用層析試紙檢測技術有較大提升，可用于各類食用農產品中ZEN的快速準確檢測。

2 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是常見的霉菌毒素之一，其化學名稱為3,7,l5-三羥基-12,13-環氧單端孢霉-9-烯-8-酮（3,7,l5-trihydroxy-12,13-epoxytrichothec-9-en-8-one），是一種無色針狀結晶，熔點為151～153 ℃，可溶于水和極性溶劑。多數來源于污染的糧食、飼料和食品中，對人和動物可以產生廣泛的毒性效應。研究表明脫氧雪腐鐮刀菌烯醇可以對人和動物的免疫功能產生明顯影響，具有明顯胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遺傳毒性。鑒于對人類生命健康的巨大威脅，國內外對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的研究開展均較多。

DON具有較強的熱抵抗力和耐酸性。DON在pH 4.0條件下，100 ℃和120 ℃加熱60 min均不被破壞，170 ℃加熱60 min僅少量被破壞；在pH 7.0條件下，100 ℃和120 ℃加熱60 min仍很穩定， 170 ℃加熱15 min部分被破壞；在pH 10.0條件下，100 ℃加熱60 min部分被破壞，120 ℃加熱30 min和170 ℃加熱15 min完全被破壞。在食用農產品中一旦產生很難消除，會對人們的生命健康造成較大的威脅。通常在低溫、潮濕和收割季節，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇容易在食用農產品中檢出。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）的檢測技術主要包括高效液相色譜-質譜法、酶聯免疫法、薄層色譜法、電化學法和表面側流免疫層析法、光譜法、等離子共振法等，路念等[4]基于核適配體技術開發了一種優于以上方法的新方法，該研究通過標記FAM的DON核酸適配體（PDON），在DON存在的情況下，PDON可以和DON特異性結合，通過π-π堆積的非共價作用吸附到Fe3+摻雜的聚多巴胺納米球（Fe-PDANS）上，用基于熒光共振能量轉移原理（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）的熒光適配體傳感器對陽性小麥中的DON進行檢測，其檢出限為0.118 2 ng·mL-1，所構建的熒光適配體傳感器反應快速、靈敏，且具有良好的特異性和重復性，其檢測結果與酶聯免疫檢測法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）所得結果關聯性好。通過摻入Fe3+提高傳感器中聚多巴胺納米球（Polydopamine Nanospheres，PDANS）對6-羧基熒光素（6-Carboxyfluorescein，6-FAM）的淬滅能力，大大提升了檢測的靈敏度和準確性，節省了檢測時間和成本。

3 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是黃曲霉和寄生曲霉等菌株產生的雙呋喃環類毒素。有B1、B2、G1、G2、M1、M2約20種衍生物。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）癌癥研究機構將黃曲霉毒素（AFT）劃定為一類天然存在的致癌物，是毒性極強的劇毒物質。其中B1是目前已知致癌物質中致癌性最強烈的，能誘發動物肝癌，能引起某些動物急性中毒。

開發及時、快速、高效的檢測方法，做到早發現、早治療對保障人們的身體健康至關重要。常用的檢測方法有酶聯免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）和高效液相色譜法，我國國家標準也采用這兩種方法對我國食用農產品中黃曲霉毒素進行檢測。

ELISA是在免疫酶技術的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術。其原理是將一定濃度的抗原或者抗體通過物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待檢標本，通過酶標物顯色的深淺間接反映被檢抗原或者抗體的存在與否或者量的多少。高效液相色譜法是通過標準品流出色譜柱的時間實現對樣品的定性，用標準品繪出標準曲線來實現檢測樣品中黃曲霉毒素的相對定量檢測。

國內外近年來研究領域對于黃曲霉毒素檢測技術的研究多集中在光譜法、色譜法、質譜法、電化學法、試紙條法等。最新江蘇科技大學葉華[5]等開發了黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的快速熒光檢測技術，研究成果有很高的應用價值。該研究以核酸適配體作為分子探針，利用氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）淬滅熒光的特點結合其吸附單鏈DNA的特點，構建一種熒光生物傳感器用來快速檢測AFB1，該方法檢測靈敏度高，特異性好，時效性強，樣品加標回收試驗表明回收率為85.0%～114.4%，檢測限達到2.37 ng·mL-1，可以在30 min內快速檢測出AFB1。該技術不僅在AFB1的檢測上取得了突破性進展，而且給其他類型黃曲霉毒素乃至其他生物毒素的檢測提供了新的思路和方法。

4 赭曲霉毒素

赭 曲 霉 毒 素（Ochratoxin，OT）化 學 分 子 式為C20H18ClNO6，屬于異香豆素類化合物，曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）的部分菌株可以產生赭曲霉毒素。1987年國際癌癥研究機構將OTA定義為Ⅲ類致癌物，其在人體內長期積累可引起腫瘤的發生，被公認為農業中五大類真菌毒素之一。我國食品安全國家標準中分別采用免疫中和層析凈化液相色譜法、離子交換固相萃取柱凈化高效液相色譜法、免疫親和層析凈化液相色譜-串聯質譜法對不同農產品中的赭曲霉毒素進行檢測；近年來也有熒光標記的快速赭曲霉毒素檢測技術出現，研究者利用熒光共振能量轉移（Fluorescent Resonance Energy Transfer，FRET）的原理，以熒光素和猝滅基團分別標記核酸適配體和產赭曲霉毒素核酸cDNA，實現對赭曲霉毒素A的快速準確檢測。

5 結語

近年來，各類毒素產生原因及危害機制的基礎研究已廣泛展開，對減少食品中毒素具有積極影響。檢測市場迫切需要實現真菌毒素準確、靈敏、多組分同時檢測，快速靈敏的檢測設備開發也是未來該領域的研究趨勢。研究人員和檢測人員應拓寬思路，實現多學科聯合互動，開發出更加高效科學的檢測技術，為食品安全保駕護航。此外，隨著真菌毒素檢測技術和相關研究的深入，一些新的毒素不斷被檢出，這些毒素尚未列入國家和各級風險監測和監督監管計劃，也沒有限量標準。目前監管部門發布的數據顯示，食用農產品中出現新興鏈格孢毒素和鐮刀菌毒素范圍和頻率較高，建議監管部門和相關研究部門盡快開展課題研究，對毒素的毒理學和作用機制、檢測技術、限量標準進行深入研究，建立標準體系，進一步加強監管。