腦型肌酸激酶促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖

梁盼盼，朱秋泓，周文超

（中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部附屬第一醫(yī)院病理科，合肥 230036）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma, GBM）是一種常見的惡性原發(fā)性腦腫瘤[1,2]，患者中位生存期僅為12～16 個(gè)月[3,4]。GBM 中的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells, GSCs）具有很強(qiáng)的自我更新、多向分化和治療抵抗能力，與GBM 的惡性發(fā)展和治療抵抗密切相關(guān)，是GBM 中的關(guān)鍵惡性細(xì)胞群體，因此是GBM 治療的主要靶細(xì)胞[1,5]。

肌酸（creatine, Cr）是臨床上用于膠質(zhì)瘤磁共振波譜（MRS）檢測(cè)的常用指標(biāo)之一，與膠質(zhì)瘤惡性程度有關(guān)[6‐8]，但其發(fā)揮促腫瘤作用的具體機(jī)制尚不清楚。在細(xì)胞中，Cr 主要作為肌酸激酶（creatine kinase, CK）的代謝底物發(fā)揮功能。CK 催化Cr 與磷酸肌酸（phosphocreatine, PCr）相互轉(zhuǎn)化，同時(shí)伴隨著ATP 的消耗或再生成，由此構(gòu)成CK/PCr 系統(tǒng)，發(fā)揮能量緩沖功能，調(diào)控細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)[9‐11]。腦型肌酸激酶（brain‐type creatine kinase, CKB）是腦組織中含量最豐富的CK 亞型[12]。研究表明，肌酸激酶/磷酸肌酸（creatine kinase/phosphocreatine, CK/PCr）系統(tǒng)對(duì)于一些具有高能量需要的細(xì)胞如神經(jīng)元、精子和肌細(xì)胞等至關(guān)重要[11]，而腫瘤干細(xì)胞相比于非干性腫瘤細(xì)胞維持更高的細(xì)胞ATP 水平[13]，因此CK/PCr系統(tǒng)可能通過(guò)促進(jìn)GSCs 維持進(jìn)而助長(zhǎng)GBM 惡性發(fā)展。基于以上推測(cè)，本文探討了CKB 催化的CK/PCr系統(tǒng)在GSCs 中的功能及其潛在的治療意義，為提供一種GSCs 的GBM 治療新方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 試劑

兔 抗CKB/CKM 多 克 隆 抗 體（15137‐1‐AP）和小鼠抗α‐tubulin 單克隆抗體（HRP‐66031）購(gòu)自Proteintech 公司；小鼠抗CKB 抗體 B‐9（sc‐373686）購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology 公司；羊抗SOX2 抗體（AF2018）購(gòu)自R&D Systems 公司；兔抗SOX2單克隆抗體（3579）購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；Alexa Fluor? 568 標(biāo)記的驢抗兔熒光二抗（A‐10042）、Alexa Fluor? 488 標(biāo)記的驢抗羊熒光二抗（A‐11055）、Hoechst 33342，三鹽酸鹽，三水合物（H3570）、HRP 偶聯(lián)的羊抗鼠二抗（A16072）、HRP 偶聯(lián)的羊抗兔二抗（65‐6120）均購(gòu)自Invitrogen公司；RPMI 1640(C3010‐0500)、DMEM 高糖培養(yǎng)基（C3113‐0500）和Trypsin EDTA Solution A（C3530）均來(lái)自VivaCell 公司；胎牛血清（FB25015）來(lái)自CLARK 公司；Neurobasal?‐A Medium（12349‐015）和50×B‐27 補(bǔ) 充 劑（17504044）來(lái) 源 于Gibco 公司；丙酮酸鈉溶液（03‐042‐1B）、非必需氨基酸溶液（01‐340‐1B）、青鏈霉素溶液（03‐031‐1B）和L‐谷氨酰胺溶液（03‐020‐1A）均來(lái)源于BI 公司；Accutase（7922）來(lái)源于STEMCELL 公司；重組人表皮生長(zhǎng)因子EGF（1150‐04‐1000）來(lái)源于GoldBio公司；重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF（100‐18B‐1000）來(lái)源于Peprotech 公司；CCK8‐試劑（A311‐02）來(lái)源于Vazyme 公司；環(huán)肌酸（377627）來(lái)源于Sigma‐Aldrich 公司；磷酸肌酸（19333‐65‐4）來(lái)源于阿拉丁公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

H2S‐GSC 細(xì)胞系獲贈(zèng)于美國(guó)匹茲堡大學(xué)的Jeremy N Rich 教授，懸浮生長(zhǎng)于Neural Basal 完全培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基配方為：500 mL Neurobasal?‐A Medium+10 mL B‐27 補(bǔ)充劑（50×）+5 mL 丙酮酸鈉溶液+5 mL 非必需氨基酸溶液+5 mL L‐谷氨酰胺溶液+500 μL 青霉素/鏈霉素溶液+10 μL 重組人表皮生長(zhǎng)因子EGF（1 mg/mL）+10 μL 重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF（1 mg/mL），置于37 ℃ 5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。H2S‐NSTC 細(xì)胞通過(guò)含有10%～20%胎牛血清的RPMI‐1640 培養(yǎng)基對(duì)H2S‐GSC 進(jìn)行誘導(dǎo)分化7 ～10 d 獲得。

3 膠質(zhì)瘤組織收集

本實(shí)驗(yàn)所涉及的膠質(zhì)瘤組織收集經(jīng)過(guò)中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，從中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)室收集，包含3 例WHO IV級(jí) GBM 樣本（患者女66 歲，男73 歲和男73 歲）。

4 生物信息學(xué)分析方法

膠質(zhì)瘤靜脈和足背靜脈血漿代謝組學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)源于Xiong N 等[14]發(fā)表的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，分別計(jì)算13個(gè)患者相應(yīng)的膠質(zhì)瘤靜脈/足背靜脈比值，對(duì)13 組比值求平均得到FC（Fold change），并計(jì)算log2FC，篩選出log2FC ＞ 1.5 且P ＜ 0.05 的代謝物認(rèn)為其在膠質(zhì)瘤靜脈中顯著上調(diào)，篩選出log2FC ＜ ‐0.2 且P＜ 0.05 的代謝物認(rèn)為其在膠質(zhì)瘤靜脈中顯著下調(diào)。GBM 單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)源于Neftel 等[15]發(fā)表的研究成果（GEO：GSE131928），使用PCA 對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，使用原始Louvain 算法進(jìn)行聚類，使用tSNE 進(jìn)行可視化，降維、聚類和可視化算法均基于R 語(yǔ)言實(shí)現(xiàn)；通過(guò)單細(xì)胞拷貝數(shù)變異（CNV）分析區(qū)分惡性腫瘤細(xì)胞和非惡性細(xì)胞；進(jìn)而通過(guò)特定細(xì)胞類型的分子標(biāo)記物基因集合的綜合表達(dá)情況將非惡性細(xì)胞分群為巨噬細(xì)胞（CD14、AIF1、FCER1G、FCGR3A、TYROBP、CSF1R）、T 細(xì) 胞（CD2、CD3D、CD3E、CD3G）和少突膠質(zhì)細(xì)胞（MBP、TF、PLP1、MAG、MOG、CLDN11）。分離出腫瘤細(xì)胞群，通過(guò)干性相關(guān)基因集（OLIG1、OLIG2、SOX2、SOX4、SOX9、SOX11、STMN2、STMN4、OMG、PLLP、DCX、DLX5、CD44 和PROM1）的綜合表達(dá)情況對(duì)單細(xì)胞的干性程度進(jìn)行打分。

5 Western blot

收集細(xì)胞，加入適量裂解液裂解，4 ℃ 13000 r/min 離心10 min，取上清液，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液制備成一定濃度的蛋白樣，煮沸10 min，取10 μg 進(jìn)行SDS‐PAGE 電泳，蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDE 膜上，加5%脫脂牛奶封閉1 h，4℃一抗稀釋液（1 ∶1000 ～1 ∶2000）孵育過(guò)夜，TBST 緩沖液洗膜3 次×5 min，孵育特超敏ECL 化學(xué)發(fā)光底物，使用Bio‐Rad 化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀進(jìn)行顯影。

6 qRT-PCR

RNA 抽 提、反 轉(zhuǎn) 錄cDNA 和qRT‐PCR 等 步驟中所用試劑分別為EZ‐10 柱式總RNA 抽提試劑 盒（BBI, B610583）、PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa，RR036A）和熒光定量PCR 試劑盒SYBR Green（Biosharp, BL705A），具體操作依據(jù)試劑商提供的標(biāo)準(zhǔn)說(shuō)明書進(jìn)行。引物序列：CKB 上游——5’‐TTCTCAGAGGTGGAGCTGGT，下 游 ——5’‐AGGCATGAGGTCGTCGAT；SOX2上 游——5’‐GCTGCGAACAGTCAGACAGA， 下游——5’‐ACCTCCCGTCCAAGGTAG；PRL13A 上游——5’‐CTCAAGGTCGTGCGTCTG，下游——5’‐TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC。

7 免疫熒光染色

組織切片使用磷酸鹽緩沖液（PBS）常溫潤(rùn)洗5 min，4%多聚甲醛常溫固定15 min，PBS 洗片3 次×5 min，含1%牛血清白蛋白、0.3% TritonX‐100 的PBS 溶液透膜封閉1 h，PBS 洗片5 min，4 ℃一抗稀釋液（1 ∶200 ～1 ∶300）孵育過(guò)夜，PBS 洗片3 次×5 min，常溫?zé)晒舛瓜♂屢海? ∶1000）和Hoechst 染料（0.00005%）避光孵育2 h，PBS 避光洗片3 次×5 min，封片劑封片，干燥1 h 以上即可使用熒光顯微鏡觀察。

8 慢病毒包裝與轉(zhuǎn)染

本實(shí)驗(yàn)所用慢病毒包裝細(xì)胞為293T 細(xì)胞；慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2（Plasmid #12260）和pCI‐VSVG（Plasmid #1733）來(lái)源于Addgene；敲低質(zhì)粒shNT、shCKB‐1 和shCKB‐2 插 入 序 列 分 別 為5’‐CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTC‐GAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTT‐3’（shNT）、5’‐CCGGCGAGGAGTCCTACGAAGT‐GTTCTCGAGAACACTTCGTAGGACTCCTC‐GTTTTTTG‐3’（shCKB‐1）、5’‐CCGGC‐CCAGATTGAAACTCTCTTCACTCGAGTGAAGA‐GAGTTTCAATCTGGGTTTTT‐3’（shCKB‐2）。 利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，病毒包裝質(zhì)粒與目的表達(dá)質(zhì)粒比例為6 μg ∶6 μg ∶6 μg，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，再48 h 后收集含病毒培養(yǎng)基上清。

9 CCK-8 實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞制備成每毫升1.25×104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中，每孔添加200 μL 的細(xì)胞懸液（2500 個(gè)細(xì)胞），空白對(duì)照組則添加200 μL 的培養(yǎng)基，每組4 重復(fù)。檢測(cè)時(shí)每孔加入20 μL CCK‐8 試劑，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育2 h后，測(cè)定OD450。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中所有柱狀圖、散點(diǎn)圖和折線圖均使用Graphpad prism 8.0 軟件繪制。柱狀圖和散點(diǎn)圖使用非配對(duì)t檢驗(yàn)（非參數(shù)，雙尾檢驗(yàn)）分析兩組數(shù)據(jù)間差異的顯著性；折線圖使用雙因素方差分析（多重比較檢驗(yàn)，Tukey 法）分析差異的顯著性。*表示P＜ 0.05，**表示P＜ 0.01，***表示P＜ 0.001，P＜0.05 表示兩組數(shù)據(jù)間存在差異。

結(jié) 果

1 膠質(zhì)瘤靜脈血中Cr 含量顯著上升

為了探究膠質(zhì)瘤與正常組織的代謝差異，基于Xiong N 等[14]發(fā)表的代謝組數(shù)據(jù)分析13 例膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤靜脈與相對(duì)應(yīng)足背靜脈血液樣本中存在差異的代謝物。通過(guò)熱圖（圖1A）展示膠質(zhì)瘤靜脈相比于足背靜脈血液樣本中含量顯著升高或降低的代謝物。Cr 水平在所有膠質(zhì)瘤靜脈相比于足背靜脈血液中均顯著上調(diào)（圖1B）。Cr 的主要功能是作為CK 的代謝底物參與到CK/PCr 系統(tǒng)中調(diào)控細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)[16]（圖1C），而CKB 是主要存在于腦組織的CK 同工酶。

2 CKB 在干性樣腫瘤細(xì)胞群中高表達(dá)

基于Neftel 等[15]發(fā)表的GBM 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)集分析Cr 代謝的催化酶基因CKB 在干性樣腫瘤細(xì)胞群和非干性腫瘤細(xì)胞群中的相對(duì)表達(dá)水平。首先從GBM 單細(xì)胞數(shù)據(jù)中分離出腫瘤細(xì)胞群（圖2A），并通過(guò)干性相關(guān)基因集的綜合表達(dá)情況對(duì)單細(xì)胞的干性程度進(jìn)行打分（圖2B）。接著分析CKB 在腫瘤細(xì)胞群中的表達(dá)，結(jié)果顯示高表達(dá)CKB細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞群中分布范圍基本與高干性細(xì)胞的分布范圍一致（圖2C）。將圖2B 中干性得分相對(duì)較高的細(xì)胞群定義為干性樣腫瘤細(xì)胞群，反之為非干性腫瘤細(xì)胞群，進(jìn)而分析CKB 在干性樣腫瘤細(xì)胞群和非干性腫瘤細(xì)胞群中的表達(dá)，結(jié)果顯示CKB在干性樣腫瘤細(xì)胞群中有著更高和更廣泛的表達(dá)水平（圖2D）。最后，通過(guò)對(duì)Mario L. Suvà 等[17]發(fā)表的GSCs 和從GSCs 誘導(dǎo)分化而來(lái)的NSTCs 的混樣轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了CKB 在GSCs 相對(duì)于NSTCs 中表達(dá)上調(diào)（圖2E）。

3 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞CKB 較非干性腫瘤細(xì)胞顯著增高

通過(guò)Western blot 和qRT‐PCR 技術(shù)，分別從蛋白和mRNA 水平檢測(cè)CKB 在GSCs 和NSTCs 中的表達(dá)水平顯示：CKB 在GSCs 的表達(dá)水平顯著高于NSTCs（圖3A，3B）。接下來(lái)，收集3 例手術(shù)切除的GBM 冰凍切片，通過(guò)免疫熒光染色分析CKB 和SOX2 在GBM 組織內(nèi)的分布情況，結(jié)果顯示CKB與干性標(biāo)記物SOX2 呈現(xiàn)一種共標(biāo)的染色模式。隨后，統(tǒng)計(jì)3 張免疫熒光染色圖中CKB+像素點(diǎn)分別在SOX2+和SOX2﹣區(qū)域所占的比例，結(jié)果顯示CKB+SOX2+的細(xì)胞比例顯著高于CKB+SOX2﹣的細(xì)胞，說(shuō)明在人體內(nèi)的GBM 組織中，CKB 也更傾向于在SOX2+細(xì)胞中高表達(dá)（圖3C）。

圖3 CKB 的蛋白和mRNA 水平在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞相比于非干性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)差異分析。A，Western blot 檢測(cè)CKB 的蛋白水平在GSCs 較NSTCs 中的表達(dá)。B，qRT‐PCR 檢測(cè)CKB 的mRNA 水平在GSCs 較NSTCs 中的表達(dá)（***P ＜ 0.001，n=4）。C，免疫熒光染色檢測(cè)CKB和SOX2 在GBM 組織冰凍切片中的共定位，并統(tǒng)計(jì)CKB+像素點(diǎn)分別在SOX2+和SOX2‐區(qū)域所占的比例（*P ＜ 0.05，n=3）。比例尺，25 μmFig. 3 Expression difference of CKB in glioma stem cells compared with non‐stem tumor cells. A, the protein level of CKB in GSCs and NSTCs was detected by Western blot. B, the mRNA level of CKB in GSCs and NSTCs was detected by qRT‐PCR (***P ＜ 0.001, n=4). C, the co‐localization of CKB and SOX2 in the frozen sections of glioblastoma tissues was detected by immunofluorescence staining, and the proportion of CKB+ pixels in SOX2+ and SOX2‐ regions was calculated (*P ＜ 0.05, n=3). Scale bar, 20 μm

4 敲低CKB 顯著抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖

為了探討CKB 在GSCs 中是否發(fā)揮功能，使用兩個(gè)靶向于CKB 的shRNA（shCKB‐1 和shCKB‐2）分別在GSCs 和NSTCs 中敲低CKB（圖4A），通過(guò)CCK‐8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低CKB能否對(duì)GSCs和NSTCs的存活和增殖產(chǎn)生影響，結(jié)果顯示敲低CKB 明顯抑制GSCs 的增殖，而對(duì)NSTCs 影響較小（圖4B），進(jìn)一步通過(guò)體外成球?qū)嶒?yàn)證明CKB 為GSCs 增殖所必須（圖4C）。

圖4 敲低CKB 對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和非干性腫瘤細(xì)胞存活和增殖的影響。 A，Western blot 檢測(cè)靶向于CKB 的shRNA 在GSCs 和NSTCs 中敲低CKB 的程度。B，CCK‐8 實(shí)驗(yàn)分析敲低CKB 對(duì)GSCs 與NSTCs 存活和增殖的影響（*/***P ＜ 0.05/0.001；ns 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，n=4）。C，體外成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)敲低CKB 對(duì)GSCs 成球能力的影響，細(xì)胞明場(chǎng)圖片于顯微鏡100×放大倍數(shù)下采集，細(xì)胞球數(shù)目為顯微鏡圖片中4 cm×4 cm方框內(nèi)的細(xì)胞球個(gè)數(shù)，細(xì)胞球尺寸為單個(gè)細(xì)胞球的直徑（***P ＜ 0.001，n=5）。比例尺：50 μmFig. 4 Effects of knocking down CKB on survival and proliferation of glioma stem cells and non‐stem tumor cells. A, the effect of CKB knock‐down by CKB‐targeting shRNA in GSCs and NSTCs was detected by Western blot. B, cell survival and proliferation of the CKB knock‐down GSCs and NSTCs was detected by CCK‐8 assay (*/***P ＜ 0.05/0.001, ns statistically non‐significant, n=4). C, the sphere formation efficiency of CKB knock‐down GSCs in vitro. The bright field pictures of GSCs were collected under the microscope 100× magnification. The sphere number was the number of cell spheres in the box of 4 cm × 4 cm in the microscope pictures, and the sphere size was the diameter of a single spheroid (***P ＜ 0.001, n=5). Scale bar, 50 μm

5 CKB 在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的功能依賴于CK/PCr系統(tǒng)

為了探究CKB是否通過(guò)CK/PCr系統(tǒng)促進(jìn)GSCs生存和增殖，本實(shí)驗(yàn)使用一系列濃度梯度的環(huán)肌酸（cyclocreatine，CCr）分別處理GSCs 和NSTCs 48 h。CCr 是Cr 類似物，也可被CKB 磷酸化產(chǎn)生磷酸環(huán)肌酸（Phosphocyclocreatine，P‐CCr），但是P‐CCr 的轉(zhuǎn)化效率僅為PCr 的1/160，可在功能上阻斷CK/PCr 系統(tǒng)[18]（圖5A）。結(jié)果顯示CCr 以劑量依賴的效應(yīng)降低GSCs 的細(xì)胞活力，而對(duì)NSTCs 的影響較小（圖5B）。此外，在敲低CKB 的GSCs 中加入Cr 的代謝產(chǎn)物PCr，能在一定程度上挽救敲低CKB 導(dǎo)致的GSCs 細(xì)胞活力下降（圖5C）。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明CKB 在GSCs 中所發(fā)揮的重要作用依賴于CK/PCr 系統(tǒng)。

圖5 環(huán)肌酸對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和非干性腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響以及磷酸肌酸對(duì)CKB 敲低膠質(zhì)瘤干細(xì)胞細(xì)胞活力的挽救能力。A，肌酸、磷酸肌酸、環(huán)肌酸和磷酸環(huán)肌酸的分子結(jié)構(gòu)（Cr：肌酸，PCr：磷酸肌酸，CCr：環(huán)肌酸，P‐CCr：磷酸環(huán)肌酸）。B，CCK‐8 實(shí)驗(yàn)分析使用環(huán)肌酸抑制CKB 的代謝功能對(duì)GSCs 和NSTCs 細(xì)胞活力的影響（**/***P ＜ 0.01/0.001, ns 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，n=4）。C，CCK‐8 實(shí)驗(yàn)分析100 μM 磷酸肌酸對(duì)CKB 敲低的GSCs 細(xì)胞活力的挽救能力（*/***P ＜ 0.05/0.001, ns 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，n=4）。Fig. 5 Effect of cyclocreatine treatment on the proliferation of glioma stem cells and non‐stem tumor cells and the rescue ability of phosphocreatine on CKB knock‐down glioma stem cells. A, the molecular structure of creatine (Cr), phosphocreatine (PCr), cyclocreatine (CCr) and phosphocyclocreatine(P‐CCr). B, effect of cyclocreatine treatment on the proliferation of glioma stem cells and non‐stem tumor cells was analyzed by CCK‐8 assay (**/***P＜ 0.01/0.001, ns statistically non‐significant, n=4). C, the rescue ability of 100 μM phosphocreatine on CKB knock‐down glioma stem cells (*/***P ＜0.05/0.001; ns statistically non‐significant, n=4)

討 論

GBM 是一種最惡性的原發(fā)性腦腫瘤[1,2]。在GBM 中存在一群關(guān)鍵惡性細(xì)胞GSCs，與GBM 的惡性發(fā)展[19‐21]、治療抵抗[22,23]和復(fù)發(fā)[24]等過(guò)程密切相關(guān)，是GBM 治療的潛在策略。據(jù)報(bào)道，GSCs與NSTCs 具有顯著不同的代謝特征[25]，代謝過(guò)程是腫瘤細(xì)胞用以維持自身存活和惡性增殖的核心機(jī)制，因此靶向抑制GSCs 特異的代謝過(guò)程可能對(duì)其產(chǎn)生強(qiáng)大的殺傷效應(yīng)。本研究通過(guò)對(duì)Xiong N[14]等發(fā)表的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤靜脈比足背靜脈血液樣本中存在更高水平的Cr。此外，在臨床膠質(zhì)瘤MRS 診斷中，Cr 與其他一些顱內(nèi)代謝物的定性和定量分析常被用于膠質(zhì)瘤的鑒定、分級(jí)預(yù)測(cè)和腫瘤邊界描繪[6]，這進(jìn)一步提示了Cr 可能與膠質(zhì)瘤的惡性發(fā)展有關(guān)。Cr 是CK/PCr 系統(tǒng)中CK 的代謝底物，被催化與ATP 產(chǎn)生高能磷酸化合物PCr，后者負(fù)責(zé)在時(shí)間和空間層面?zhèn)鬟f能量，對(duì)于一些高能量和能量劇烈波動(dòng)的細(xì)胞如神經(jīng)元、精子和肌細(xì)胞等至關(guān)重要[11]。有研究表明，GSCs 比NSTCs 維持更高的細(xì)胞能量狀態(tài)[13]，因此推測(cè)CK/PCr 系統(tǒng)可能在GSCs 中發(fā)揮了重要作用。基于此推測(cè)，本文探討了CK/PCr 系統(tǒng)在GSCs 中的功能及其潛在的治療意義。

CK 是CK/PCr 系統(tǒng)關(guān)鍵的催化酶，而CKB 是腦組織中含量最為豐富的CK 亞型[12]，本研究首先對(duì)CKB 在GSCs 和NSTCs 中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。基于Neftel 等[15]發(fā)表的GBM 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)集進(jìn)行單細(xì)胞分群，從中分離出腫瘤細(xì)胞，并使用一系列干性相關(guān)基因的綜合表達(dá)情況篩選出干性樣腫瘤細(xì)胞和非干性腫瘤細(xì)胞，通過(guò)分析CKB 在兩個(gè)細(xì)胞群中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)CKB 在干性樣腫瘤細(xì)胞群中有著更高和更廣泛的表達(dá)水平，這提示CKB 可能在GSCs 相比于NSTCs 中具有更高的表達(dá)水平。緊接著基于Mario L. Suvà 等[17]發(fā)表的GSCs 和NSTCs的混樣轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了CKB 在GSCs 相對(duì)于NSTCs 中表達(dá)上調(diào)。隨后，本研究也在體外GSC 細(xì)胞系和分化的NSTCs 細(xì)胞中證實(shí)，CKB 的mRNA 和蛋白水平均在GSCs 較NSTCs 中顯著高表達(dá)。本研究進(jìn)一步探究了CK/PCr 系統(tǒng)在GSCs 中發(fā)揮的功能，敲低CKB 或使用抑制劑CCr抑制Cr 代謝能顯著抑制GSCs 的存活和增殖能力，而對(duì)NSTCs 的影響較小，而使用Cr 的代謝產(chǎn)物PCr則在一定程度上挽救了CKB敲低導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，這表明CKB 依賴其對(duì)Cr 的代謝活性促進(jìn)GSCs 的存活和增殖。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CKB 在GSCs中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)CK/PCr 系統(tǒng)促進(jìn)GSCs 的存活和增殖，是殺傷GSCs 來(lái)治療GBM 的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

本研究?jī)H初步探討了CKB 在GSCs 中的表達(dá)情況和功能。有研究表明CKB 通過(guò)直接調(diào)控細(xì)胞的能量穩(wěn)態(tài)或某些癌基因的表達(dá)水平促進(jìn)包括乳腺癌[26]、結(jié)直腸癌[27]、胰腺導(dǎo)管癌[28]、黑色素瘤[29]和人骨肉瘤[30]等多種癌癥的進(jìn)展，CKB 是否影響GSCs 的細(xì)胞能量水平以及發(fā)揮信號(hào)通路的調(diào)控功能還有待進(jìn)一步探討。