核固紅、中性紅和伊紅復染液在含鐵血黃素染色中的應用比較

林婷，吳在增，康福，溫虹，周冬梅

（福建醫科大學腫瘤臨床醫學院，福建省腫瘤醫院，福州 350012）

普魯士藍反應（Perls）是經典的組織化學反應，可用于識別3價鐵離子。血紅蛋白被巨噬細胞吞噬后經溶酶體降解釋放出的3 價鐵離子與蛋白結合后形成金黃色的顆粒，稱含鐵血黃素。含鐵血黃素染色是病理診斷技術中常用到的方法，應用Perls 反應和復染液襯染，可以顯示和證明組織內3 價鐵離子的存在及各種出血性病變。在實際工作中由于缺乏統一的指導意見，不同的實驗室采用不同的復染液進行染色，導致染色結果參差，不利于診斷。本實驗對3 種常用的復染液, 核固紅、中性紅和伊紅復染液在含鐵血黃素染色中的染色情況進行對比，分析各自的特點，以期為獲得理想的實驗結果提供參考。

材料與方法

1 材料

收集福建省腫瘤醫院病理科標本組織，均已明確含鐵血黃素陽性，其中，肝臟組織、肺組織、胃組織、乳腺組織各1 例。含鐵血黃素染色試劑盒購自福州邁新公司，主要包括亞鐵氰化鉀染液，促染劑。核固紅（上海化學試劑廠），中性紅（上海試劑三廠），硫酸鋁鉀（永大試劑），伊紅（上海國藥）。

2 方法

2.1 試劑配制

根據病理技術相關專業書籍中的介紹[1]，選用3 種復染液進行實驗，包括0.1%核固紅、0.5%中性紅、1%伊紅。0.1%核固紅溶液：5 g 硫酸鋁鉀溶于100 mL 蒸餾水中配制5%硫酸鋁鉀水溶液，再加入0.1 g 核固紅，加溫至充分溶解后冷卻至室溫使用。0.5%中性紅：稱取1 g 中性紅粉劑，加入200 mL 蒸餾水中，攪拌至充分溶解，室溫放置備用。1%伊紅：將1 g 伊紅加入到100 mL 的95%乙醇中充分溶解，加入1‐2 滴冰醋酸后室溫保存。

2.2 染色方法

常規脫水、石蠟包埋的組織塊，每例標本切5片，厚度為4μm；常規脫蠟至水，并用蒸餾水充分沖洗；將亞鐵氰化鉀染液和促染劑等量混合，現配現用；滴加配好的亞鐵氰化鉀和促染劑混合染液，充分覆蓋組織并孵育15 min；蒸餾水沖洗3 遍；分別用0.1%核固紅、0.5%中性紅、1%伊紅孵育切片10 min；核固紅與中性紅染色的切片經蒸餾水沖洗后風干直接封片，伊紅染色的切片放入梯度酒精脫水（每一級各10 s），二甲苯透明，中性樹膠封片。

結 果

以不同復染液染色后觀察切片染色效果，在4種組織中觀察到的染色效果一致：核固紅組細胞核呈淡紅色，含鐵血黃素呈深藍色，二者顏色對比較強；中性紅組顏色艷麗，定位細胞核，普魯士藍呈藍灰色，顏色對比好；伊紅組顏色鮮艷，定位細胞質，HE 形態可見，對比度較弱。圖1 所示為肺組織切片染色效果。

圖1 3 種復染液在肺組織上的染色效果比較。A，0.1%核固紅溶液；B，0.5%中性紅；C，1%伊紅。比例尺，100 μmFig. 1 Comparison of the staining effects of three counterstaining solutions on lung tissue. A, 0.1% nuclear fast red; B, 0.5% neutral red; C, 1% eosin.Scale bar, 100 μm

討 論

常規HE 切片在鏡下觀察到棕色色素但尚不能明確其來源時，可行含鐵血黃素染色進行鑒別[2]。含鐵血黃素染色多用于顯示組織中鐵離子的存在，對貧血及出血性疾病的診斷有益，但對腫瘤診療的指導作用不大。近年來隨著對鐵代謝研究的深入，越來越多的學者認為鐵代謝及鐵死亡與許多腫瘤的發生發展及預后相關，檢測鐵的表達在腫瘤診斷和治療中的作用逐漸顯露。Kim 等[3]提出鐵死亡是腫瘤微環境中病理性激活的中性粒細胞的一種獨特且可靶向的免疫抑制機制，可以通過藥理學調節來限制腫瘤進展。Behrouz Hassannia 等[4]認為可通過靶向鐵死亡治療癌癥。陳菲等[5]將普魯士藍與油紅O套染建立鐵死亡模型以研究鐵死亡中鐵離子與脂質的關系。因此對含鐵血黃素染色的方法進行統一規范，指導病理技師在日常工作及科學研究中更加高效制出精良的切片，就有了更大的意義。

本研究中，核固紅復染細胞核定位清晰，顏色淡紅，與普魯士藍對比度好。研究選用李莉等[6]推薦的配置方法，用0.5%硫酸鋁鉀水溶液配制0.1%核固紅，切片染色效果好，核固紅用量較少，配制成本較低，硫酸鋁鉀為病理科常用試劑，用于蘇木素染液配制，獲取方便。中性紅復染使細胞核呈紅色，顏色亮麗，普魯士藍呈藍灰色，對比明顯。中性紅使用蒸餾水配制，操作簡單。伊紅復染可顯示細胞質、紅細胞與肌肉，無法顯示細胞核，與普魯士藍對比較弱，復染后需經酒精分化，步驟較為繁瑣。綜合比較三種復染液，推薦使用0.1%核固紅進行復染，染色對比效果更佳。

普魯士藍反應是利用酸化的亞鐵氰化鉀與三價鐵反應生成不溶解的藍色化合物，反應式為 4FeCl3+3K4Fe(CN)6→Fe4［Fe(CN)6］3+12KCl。實驗中應注意等比例混合亞鐵氰化鉀與鹽酸水溶液，染色過程避免使用金屬鐵制品和容器，使用蒸餾水沖洗，防止自來水中的鐵離子與組織中的鈣鹽結合產生假陽性結果。需注意的是，染液的溫度和反應的溫度都會影響反應的進行及染色結果的觀察。可以利用微波加熱，縮短鐵氰化鉀與鹽酸的反應時間，加快染色速度，但也有實驗室認為反應過程中加熱會導致切片和組織上出現細小的藍色沉淀[1]，不利于診斷。因此，染色前準備中染液的復溫就顯得格外重要。筆者在日常工作中發現，核固紅的溶解度較差，配制后置于4℃冰箱保存，使用前若僅置于室溫復溫則不易上色，延長染色時間則制片效率降低，且染色效果較差。于是筆者將核固紅染液置于4℃冰箱保存1 周后分別在室溫和37℃溫箱進行復溫比較，發現同樣復溫1h 的情況下，37℃溫箱復溫的染色效果較室溫復溫染色效果好，顏色較為艷麗，對比度好。推薦在實驗前將核固紅染液置于37℃溫箱復溫1h，可提高核固紅著色效果。

綜上所述，在相同實驗條件下，0.1%核固紅染液復染含鐵血黃素，顏色對比度較好，效果更佳。