豬偽狂犬病檢測技術研究進展

陳云蕾，吳 蘭，丁林玲，張澤林，程國華，王佳璟，張 鯤

（ 1． 桐廬縣無規定馬屬動物疫病區管理中心，浙江 杭州 310000 ；2． 桐廬縣農業農村局，浙江 杭州 310000 ； 3． 浙江康嘉基因技術有限公司，浙江 杭州 310000 ）

豬偽狂犬病（pseudorabies，PR）又稱Aujeszky 氏病，是由偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）感染引起的以發熱、腹瀉、繁殖障礙和呼吸系統癥狀為主的急性接觸性傳染病。PRV的天然宿主是豬，還可感染牛、犬、貓等多種家畜和野生動物，對世界畜牧業造成了嚴重的經濟損失[1-3]。研究發現，PRV 可跨越物種屏障并誘發人腦膜炎，但對人PRV腦膜炎的明確仍存在爭議[4]。PRV的傳播途徑包括接觸傳播、垂直傳播以及空氣傳播等，其中空氣傳播最早可追溯至1813年，但其具體機制及傳播能力尚不明確[5]。自1947 年我國首次報道豬感染PRV 以來[6]，隨后也出現了牛、山羊等多種動物感染PRV的報道，直到1970年Bartha-K61疫苗株引入我國后，PR才得以很好的控制[7]。2011年底，部分免疫Bartha-K61疫苗株的豬場出現了以神經系統疾病和仔豬高死亡率為特征的PRV 突變株[8-10]，并迅速蔓延至中國大部分地區，嚴重影響了我國養豬業的發展，也對PR 疫情防控提出了新的檢測需求，特別是在如何區分疫苗株與野毒株感染、隱性感染的鑒定、免疫保護水平評價等方面。新型檢測技術方法的出現為PR防控提供了更多選擇，但如何篩選有效的檢測方法對于PR 防控具有重要的意義。本文就PRV 蛋白結構特點、臨床癥狀、血清學診斷技術及核酸檢測技術展開敘述，闡述近年PRV新型檢測技術的靈敏度及各檢測方法臨床應用中的優缺點，以期為臨床PRV凈化、防控過程檢測方法的選擇提供參考。

1 PRV流行特點

PRV 屬于皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科，與牛皰疹病毒Ⅰ型和馬皰疹病毒Ⅰ型具有較高的同源性[11]。PRV 為線狀雙股DNA，基因組大小為143 kb，具有典型皰疹病毒特征，病毒粒子呈球形或橢圓形，有囊膜，直徑約為150～180 nm，由含病毒基因組的核蛋白核心、病毒的多面體核衣殼、蛋白衣殼和含有病毒編碼糖蛋白細胞膜的脂質雙層膜組成[12-13]；其中病毒多面體核殼皮呈二十面體結構包裹病毒DNA，具有保護病毒DNA的作用。迄今為止，已鑒定到的PRV基因有72種，主要是一些病毒復制相關的酶、結合點蛋白、轉錄因子以及相關結構蛋白和毒力蛋白等[14]。PRV 的毒力是由編碼胸腺激酶（TK）及糖蛋白gE、gI 和核苷酸還原酶（RR）等多種基因協同控制[15-17]；其中TK 基因作為主要的毒力基因，若發生失活，宿主的毒力將降低或喪失。現有的PRV 缺失疫苗株均是針對TK、gE、gI 和RR等毒力基因的缺失對機體產生保護作用[18-19]，也成為臨床通過檢測缺失疫苗株蛋白的抗體區分疫苗免疫和野毒感染動物的關鍵。

多種動物均可感染PRV，如反芻動物、嚙齒動物和食肉動物，病死率可達到100%[20-21]。豬是PRV的儲存宿主，感染后潛伏期一般為3～6 d，臨床癥狀隨年齡、感染毒株的毒力及免疫效果的不同而表現出很大差異[22-23]。PR 常以輕微或隱性感染為主，表現為一過性發熱、便秘等癥狀，多在3～4 d恢復，若繼續發展則會出現神經癥狀，偶爾也可引起死亡。妊娠母豬感染PRV 后，常經垂直傳播感染胎兒，其發病率和病死率隨著日齡增長而逐漸降低，斷乳仔豬可長期帶毒、排毒[24]。感染種豬和仔豬長期帶毒是本病長期流行和難以根除的關鍵。飼養管理不善、衛生條件差、其他疫病控制不力、各種應激均可誘發PR，且PR 無嚴格的季節性，以寒冷季節多發[11]。此外，由于PRV 本身具有很強的免疫逃逸能力，不僅豬體內能夠持續感染，破壞免疫系統，還可誘發其他疾病的產生，給養殖戶帶來極大的損失。目前尚無針對PRV有效的藥物，只能通過疫苗接種進行預防和高免血清治療降低病死率，因此高效靈敏的PRV檢測方法是臨床中PR防控和健康養殖的有效支撐。

2 PRV檢測技術

PR的檢測技術、診斷準確率是預防PRV的先決條件，早發現早防控方可有效降低養豬業的經濟損失，目前臨床PRV的常用診斷技術以血清學診斷和核酸診斷為主。

2.1 血清學檢測技術

2.1.1 酶聯免疫吸附法（ELISA）

ELISA是應用最廣泛的血清抗體檢測方法，與其他方法相比因具有更高的靈敏度和更簡單的特性而備受關注。而選擇抗體或抗原的不同則具有不同的檢測意義，以PRV gE 缺失疫苗建立的ELISA 診斷方法，可快速有效地鑒別PRV 野毒感染抗體和免疫gE 基因缺失疫苗而產生的抗體，對野毒的發現具有重要意義[25]；gB蛋白作為PRV的一種必須糖蛋白和重要免疫原，所誘導產生的中和抗體水平可以反映豬群的免疫狀態，因此，選擇gB 蛋白建立的ELISA方法可有效評估疫苗的免疫效果。

劉旻翾等[26]針對PRV gB糖蛋白高度保守的抗原優勢肽段設計的間接ELISA 方法，僅對PRV 血清檢測陽性，與其他病毒陽性血清均無反應陽性；最低檢測下限血清稀釋度為1∶128，高于IDEXX PRV/ADV gB 抗體檢測試劑盒下限稀釋度（1∶4），批內、批間重復變異系數小于10%，可有效區分疫苗免疫和野毒感染。張洪亮等[27]利用Bartha-K61株gB基因核心抗原區和閔A株gE基因核心抗原區建立了一種PRV抗體間接ELISA檢測方法，僅與陽性血清反應，敏感性可達1:1 600，批內、批間重復變異系數小于10%。趙靜[28]依據制備和篩選的gB 單克隆抗體（mAb）312H 為阻斷抗體建立的阻斷ELISA 檢測方法，與豬圓環病毒2 型（PCV2）、非洲豬瘟病毒（ASFV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）-1 DV株、PRRSV-2 F112株血清均無交叉反應，批內和批間重復性試驗的變異系數均小于3%，對PRV 變異株二倍梯度稀釋（1∶2～1∶2 048）陽性血清，比IDEXX 試劑盒敏感性高2～8 倍。PRV 變異株對gB 不同表位的抗原漂移影響和個體對不同表位的變異多樣化，阻斷ELISA會出現一定的誤判[29]，與間接ELISA相比仍需進一步優化和改進；其高靈敏度和更簡單的特性仍是鑒別疫苗免疫抗體和野毒感染抗體的首選，為PRV的防控和凈化工作提供檢測依據。

2.1.2 膠體金免疫層析技術（GICA）

GICA是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體檢測的一種新型免疫檢測技術，檢測不依賴儀器設備，具有可直接判讀結果、操作簡單、敏感性高、特異性強等優點，特別適合基層獸醫使用[30]。王華俊等[31]利用膠體金標記純化的抗PRVgB單克隆抗體10D4組裝成側向層析（LFA）方法通用膠體金層析試紙，檢測下限為1∶640、TCID50為1×108.6/0.1 mL的滅活抗原，與CSFV、PRRSV、PCV2、豬細小病毒（PPV）、PEDV 均無交叉反應。雷有玲等[27]以重組gE 蛋白和豬IgG 組裝膠體金PRV gE 抗體免疫層析試紙；最低檢出1∶1 280 倍稀釋樣品，與IDEXX gE-ELISA 抗體試劑盒符合率為95.31%。郭力偉等[32]以重組gE蛋白為免疫原，5D10 和6E8 為標記抗體和檢測抗體組裝檢測PRV野毒株的膠體金免疫層析試紙條，與CSFV、PRRSV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、PPV、PCV-2和PRV疫苗株均無交叉反應，且野毒株檢出量可達1×102.83TCID50，與PCR方法的符合率達92.59%。以gE、gB 等抗體組裝膠體金試紙條，操作簡便、靈敏度較高、不依賴設備儀器，更適合基層養殖單位進行PRV野毒的快速鑒別診斷。

2.1.3 熒光微球免疫檢測技術（FMIA）

FMIA是一種結合熒光微球作為抗原復合物結合抗體的蛋白質檢測方法，適用于單一復雜樣品中不同分析物的高通量、多重和同時檢測，檢測快速，具有較好的準確性和重復性。有研究[33-34]將PRV gE、gB 重組蛋白作為抗原分別與12號、28號磁珠微球偶聯，用gE-12、gB-28偶聯復合體作為捕獲載體，分別建立了gE、gB IgG 抗體FMIA 檢測方法，在此基礎上建立了PRV gE 和gB IgG 抗體的雙重熒光微球免疫學檢測方法。經ROC 曲線分析顯示，gE 臨界值為5 991.5 時，AUC 最大為0.981，敏感度為92.3%，特異性為99.26%；gB 臨界值為2 862 時，AUC 最大為0.989，敏感度為96.3%，特異性為95.74%；此方法具有重復性好、靈敏度高、特異性好等特點。這種方法的建立可應用于PRV野毒感染豬和疫苗免疫豬的快速鑒別診斷及保護性抗體的檢測，是一種多重抗體檢測的重要方法，為動物疫病多重抗體的檢測診斷提供了思路，值得大面積推廣。

2.1.4 競爭化學發光酶聯免疫法（CLEIA）

CLEIA是酶聯免疫分析技術與化學發光技術的結合，通過化學發光強度與反應物濃度的正比關系，檢測微量抗原或抗體的一種新型免疫測定技術[35]；比間接ELISA方法需求時間短、操作簡單，可定量分析[36]。馬震原等[36]以PRV gB蛋白組建了可快速檢測的一種競爭化學發光酶聯免疫抗體檢測方法，最低可檢測1∶2 048 稀釋的國家參考血清，與CSFV、PRRSV、PCV2 等標準陽性血清無交叉反應；與中和試驗陽性符合率為94%，陰性符合率為96.92%，明顯優于商品化ELISA 試劑盒，為PRV gB 抗體的快速定量檢測提供了一個科學可靠的技術手段。此方法快捷、敏感、高效，能夠較好地在動物疫病防控一線中推廣與應用。

2.2 核酸檢測技術

2.2.1 聚合酶鏈式反應（PCR）

PCR 由變性、退火、延伸等3個基本反應步驟構成，其特異性主要依賴與靶基因序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR一般應用于檢測血液、血清或器官樣品中的基因組序列，具有檢測速度快、操作簡單、取樣少、特異性強等優點，但PCR 檢測時需注意的是3 周內未接種過偽狂犬弱毒疫苗的豬，以免造成誤診。胡銘哲等[37]利用PRV全基因組篩選出的基因片段建立了一種鑒定Ⅰ型和Ⅱ型PRV 基因型的PCR 分型方法，檢測CSFV、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）、PRRSV、PEDV 和豬圓環病毒3 型（PCV3）時均為陰性，兩種分型方法針對Ⅰ型和Ⅱ型PRV的最低檢測限均為1×104copies/μL。該方法特異性強、靈敏度高，單重和雙重PCR 檢測結果一致。趙宇等[38]根據GenBank 中公布的PRV gE 基因和PCV3 基因組序列的保守區域設計并建立了一種能夠同時檢測PRV 和PCV3 的雙重PCR 檢測方法，對PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、PEDV 無反應，PRV最低檢測值為502.0 copies/μL，PCV3 最低檢測值為91.2 copies/μL。結果表明，該方法可快速檢測PRV 和PCV3，具有很好的特異性和靈敏度，為PRV 流行病學調查、感染豬群的清群凈化提供了有效技術手段。

2.2.2 實時熒光定量PCR（qPCR）

qPCR是將擴增過程中實時收集的熒光基因信號使用標準曲線對未知模板的定量分析。與常規PCR 方法比較更快速、靈敏、不易交叉污染，可進行定量分析，是病原學診斷中常用的方法。常晨等[39]根據PRV gI/gE基因序列建立一種鑒別PRV 野毒株的qPCR 方法，靈敏度達到102copies/μL，具有較好的特異性和重復性，經動物試驗驗證qPCR 比普通PCR 能夠更靈敏地檢出多種組織的帶毒量。溫書香等[40]利用PRV gE基因構建了一種qPCR方法，可快速、特異地鑒別野毒株與疫苗株，檢測靈敏度可達10 copies/μL，與CSFV、PRRSV、PPV、PCV 不發生交叉反應，具有良好的特異性和重復性，且與兩種商品化試劑盒驗證結果一致。此檢測方法可應用于日常PRV 野毒株與疫苗免疫株的鑒別診斷，為PRV的凈化提供技術支撐。

2.2.3 環介導等溫擴增技術（LAMP）

LAMP是由Notomi[41]利用識別靶序列上的8個特異區域和Bst DNA 聚合酶在恒溫下形成瀑布式的核酸高效擴增，具有操作方便、反應迅速、成本低廉和結果可視等優點，目前被廣泛應用于病毒、細菌、寄生蟲等病原體的檢測[42-43]。許宗麗等[43]利用PRV gB 基因的保守序列建立了一種在常規65 ℃水浴鍋中30 min內通過肉眼觀察顏色直接判定結果的LAMP 可視化檢測方法，與CSFV、PCV2 等均無反應，敏感性可達1 fg，與普通PCR 檢測結果一致。陳珍金等[44]基于LAMP引入PRV gB基因序列保守區段設計篩選出的引物建立了一種LAMP 檢測方法，與CSFV、PCV2、PRRSV等8種病原無反應，敏感性可達10 fg/μL，穩定性強，與qPCR結果高度一致，且操作簡單、便捷，此方法的建立為PRV 的快速檢測和基層檢疫提供了新的選擇。部分LAMP檢測方法的研究見表1。

2.2.4 重組聚合酶擴增（RPA）

RPA 是一種等溫DNA 擴增技術[45]，重組酶和引物形成蛋白-DNA混合物并啟動尋找模板DNA上的同源序列；已廣泛應用于多種病原微生物的快速檢測，也是一種適用于現場檢測的方法[46-48]。劉立兵等[49]根據PRV gB和gE基因保守區域設計引物，建立了一種在38 ℃恒溫反應20 min 可實現對PRV 野毒和疫苗毒的特異性鑒別檢測的雙重RPA 方法，最低檢測限均為102copies/μL，與熒光定量PCR 檢測限一致，且檢測結果符合率100%。這種方法建立的PRV雙重RPA方法特異性強，敏感性高，對儀器設備要求低，操作簡單，反應快速，對于我國豬群中國PRV的流行病學調查和防控具有重要意義。

2.2.5 DNA芯片

DNA芯片技術是一種大規模集成的固相雜交新技術，是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或DNA探針按一定序列固化于基片上的DNA陣列。寡核苷酸微陣列亦是DNA 芯片的一種。吳鳳筍等[50]利用PRV gE 基因設計、構建DNA芯片，通過對探針質量濃度、雜交溫度和雜交時間的篩選和優化實現1×10-6ng 級靈敏度，高出普通PCR 靈敏度10 倍。羅寧等[51]利用PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PPV 等10 種病毒基因的靶基因點和具有Cy3 標記的熒光標記探針制作基因芯片，并經1 006份樣品符合檢測，最低檢測濃度可達105copies/μL，與普通PCR/RT-PCR 相比，符合率96.79%以上；該研究結果為臨床開展多病原聯合檢測技術提供了思路。DNA 芯片技術特異性強、靈敏度高，是動物疫病診斷技術的研究熱點。

3 結論

PRV 變異株導致Barthk 61 疫苗株免疫后感染出現以神經系統疾病和仔豬高死亡率為特征的PR 暴發以來，疫苗免疫效果存在缺陷，且藥物治療效果不佳，使PR的防控愈加困難；只有充分了解現有PRV檢測診斷技術的靈敏度及臨床中各檢測方法的優缺點，才能更好地對PR 進行凈化。同時，PR的監測和凈化也具有重要的公共衛生意義。自首次報道以來，基于臨床癥狀、動物接觸史或血清抗體檢測結果的相關研究較多見，偶見有人類感染PRV 的報道。因此，PR 的監測與凈化不但有利于提高養豬行業的經濟效益，也會大大降低人感染PRV的風險。