牛冠狀病毒病診斷及防治的研究進展

李小龍，石亞楠，鮑顯偉，李 昊，王雪妍，許立華

（ 寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021 ）

冠狀病毒（coronaviruses，CoV）可感染家畜、家禽、野生動物和人類，其中牛冠狀病毒（bovine coronaviruses，BCoV）所引發的牛冠狀病毒病在全球大范圍存在，可引起腸道和呼吸道雙重臨床癥狀，給畜牧業造成了嚴重的經濟損失。CoV 是非節段的單股正鏈RNA 病毒，也是目前已知基因組最大的RNA 病毒，長度約為26～32 kbp。CoV 亞科可分為Alpha（α）、Beta（β）、Gamma（γ）和Delta（δ）等4 個屬，又因為同一屬中復制酶結構存在差異而劃分為不同譜系，BCoV屬于β屬。本文對牛冠狀病毒病的病原學、流行病學、致病機制、鑒別診斷和預防等方面的研究進展進行了綜述，旨在加強對牛冠狀病毒病的認知，為該病的防控提供參考。

1 牛冠狀病毒病病原學

1.1 培養特性

分離培養BCoV 的細胞主要包括非洲綠猴腎細胞（Vero 細胞）、綿羊胎腎細胞、胎牛胸腺細胞和牛腎細胞（MDBK 細胞）等細胞系。Storz 等[1]研究表明，分離培養BCoV 時添加適量胰酶可對病毒增殖和出現細胞病變（cytopathic effect，CPE）等發揮重要作用。

1.2 基因組學

迄今為止，BCoV 只有一種基因型。BCoV 的基因組約31 kb，其中包括10 個開放閱讀框（open reading frame，ORF）以及兩側的5'非翻譯區（5'UTR）和3'非翻譯區（3'UTR）。ORF1 約占5'端2/3 的基因序列，可分為ORF1a和ORF1b，分別翻譯為復制酶多聚蛋白pp1a 和pp1ab，之后被蛋白水解酶（主要為木瓜樣蛋白酶和3C樣蛋白酶）切割成數種非結構蛋白（non-structuralprotein，NSP）[2]。ORF4、8、9 和10 分別編碼結構蛋白棘突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N），其他ORF編碼額外的NSP。一些β屬病毒編碼一種凝集素酯酶輔助蛋白，稱為血凝素-酯酶蛋白（HE）[3]，基因組基本結構為5'UTRORF1a-ORF1b-HE-S-E-M-N-3'UTR-3'端聚腺苷酸尾。HE 蛋白在病毒表面形成穗狀突起，作為一種血凝素能夠與細胞表面的9-O-乙酰神經氨酸結合，外在表現為能夠凝集多種動物的紅細胞。HE 蛋白具有乙酰酯酶活性，可與糖蛋白膜表面的唾液酸結合，通過與含有9-O-乙酰化唾液酸的細胞表面結合使細胞受體失活，這種能力對病毒的傳染性至關重要[4]，并可作為第二種病毒附著蛋白啟動感染。此外，HE蛋白在體內外均可誘導產生中和抗體[5]。

S 蛋白含有大量抗原表位，主要的生物學功能是參與病毒與靶細胞的附著以及病毒和細胞膜的融合。S蛋白與細胞受體之間的相互作用是CoV 宿主范圍和組織向性的主要決定因素。S蛋白由細胞胰蛋白酶樣蛋白酶介導分裂為S1和S2亞基。S1亞基上的受體結合結構域能夠連接細胞受體[6]，以及誘導中和抗體合成和負責血凝活性。S1亞基可能與宿主范圍和組織向性有關[7]，CoV感染始于S1結構域跟宿主細胞表面受體的結合。S2 蛋白則能夠介導感染期間病毒和宿主細胞的膜融合。

E 蛋白是一種小型的膜結合型蛋白，在病毒內有少量存在，分布在病毒的包膜上，作為離子通道發揮作用，與M蛋白共同參與表達病毒包膜的形成、組裝與釋放[8]。M 蛋白是CoV 外膜的主要成分，是病毒粒子中最豐富的蛋白質[9]，還參與病毒出芽:當病毒在出芽時陷于膜內部分M蛋白的羧基末端進入核心，可維持病毒核心結構，同時加快病毒的出芽和增殖。N 蛋白與其余4 種結構蛋白不同，由細胞質內的游離核糖體合成；N蛋白包裹基因組形成核蛋白復合體，起到保護病毒遺傳物質的作用；還可與宿主蛋白結合，參與病毒轉錄、翻譯、復制、免疫調節等多個進程。此外，因為核衣殼蛋白序列高度保守，所以N 蛋白通常是病毒RNA檢測分析的主要靶蛋白[10]。

2 牛冠狀病毒病流行病學與致病機制

2.1 流行病學

目前，BCoV 在世界范圍內廣泛分布。Kim 等[11]于2019年1月—2021年6月采集韓國患有腹瀉的未斷奶犢牛糞樣846 份，陽性檢出率為5.9%。David 等[12]采集了以色列境內2017—2021 年2～6 歲發生冬季痢疾的病牛的糞便和直腸拭子853 份，使用RT-qPCR 方法進行檢測，陽性檢出率為29.3%。楊海峰等[13]對我國14 個省份的數個規模化養殖場中表現呼吸道癥狀的176頭犢牛采集咽拭子，陽性檢出率為21.59%。鄧飛等[14]對2020年3月—5月間四川387 份出現明顯腹瀉癥狀病牛的糞便樣品進行檢測，陽性檢出率為16.8%。Zhu等[15]采集黑龍江省表現明顯腹瀉的牛糞樣1 016份、鼻拭子367份，經檢測其中糞檢陽性率為12.20%、鼻拭子檢陽性率為21.53%。

BCoV 主要通過呼吸道和消化道進行傳染，故一般成群發病，且痊愈牛仍能夠通過呼吸道分泌物或排泄物持續排毒，病毒可在空氣、飲水、墊料等外界環境中長時間存在。BCoV的主要易感動物是牛，但在馬、駱駝等家畜以及犬和鹿、長頸鹿等動物身上也檢測出了“類BCoV”[16-17]。這些病毒經ELISA、免疫熒光等抗BCoV抗體檢測，結果均為陽性，證明其與BCoV 存在交叉免疫。BCoV 具有如此廣泛的宿主范圍可能是因為S 蛋白的變異[18]；也有學者認為是由于HE 蛋白的存在，該蛋白使病毒能夠與不同類型的細胞結合[19]。

2.2 致病機制

BCoV 主要通過氣溶膠-鼻途徑和糞-口途徑傳播，BCoV對細胞的入侵取決于病毒表面S蛋白與細胞受體相互作用，其對牛上呼吸道組織細胞和腸組織細胞的親嗜力較強。首先，HE 蛋白和S 蛋白參與病毒和宿主細胞的黏附，經細胞膜融合使得核衣殼進入上呼吸道組織上皮細胞或腸上皮細胞內。近年來，有研究提出CoV識別結合宿主細胞，可能使用雙受體結合基序系統[20]。病毒正鏈RNA在細胞質內利用宿主的復制酶體系完成基因組復制，被翻譯成復制酶多蛋白，之后CoV 編碼蛋白酶，以切割復制酶多蛋白生成數種單獨NSP，許多NSP 聚集組裝成復制-轉錄復合體（replicase-transcriptase complex，RTC）并負責基因組復制和亞基因組RNA的轉錄[21]。復制酶以負鏈RNA作為模板復制出互補負鏈RNA，并轉錄為正鏈RNA 和亞基因組mRNAs，而后者將作為結構蛋白和輔助蛋白的模板[22]。亞基因組翻譯表達結構蛋白HE、S、E、M和N，完成翻譯后的M、S 和E 蛋白進入內質網，隨后轉運至高爾基體，形成內質網-高爾基體中間體（ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC）[23]。N 蛋白與病毒基因組結合形成的螺旋核衣殼，而ERGIC 與具有結構蛋白的膜結合，形成新的、成熟的病毒體。子代病毒主要分布在內質網和高爾基體表面，最終在胞質空泡的平滑細胞膜區域以出芽的方式使細胞膜發生破裂[24]，進而侵入其他細胞。

BCoV通過腸道感染時，腸絨毛生長受到影響，腸上皮細胞死亡、脫落，并被未成熟的腸上皮細胞取代，出現小腸絨毛發育不良以及結腸嵴萎縮等現象[25]。BCoV以氣溶膠的形式感染上呼吸道并在呼吸道上皮細胞中繁殖，破壞呼吸道中纖毛清除功能，使機體易受其他病原體感染，在環境選擇壓力下繼發感染的可能性會上升；同時感染后期BCoV 感染的組織抑制干擾素及促炎細胞因子的釋放，造成免疫抑制[26]。且在試驗性感染中，BCoV 在動物上呼吸道中大量復制后，動物會吞咽含有該病毒的黏液分泌物進入胃腸道，通過黏液分泌物包裹的方式可能使這種不穩定但具有傳染性的BCoV轉移到腸道，導致腸道感染和通過糞便排出體外[27]。

3 牛冠狀病毒病臨床癥狀

根據不同毒株、不同感染部位，BCoV所導致的臨床表現也有所不同。BCoV依據其分離病料不同（牛鼻分泌物、肺組織和腹瀉糞便）可分為牛呼吸道冠狀病毒（BRCoV）和牛腸致病性冠狀病毒（BECov）[28]，其中BECoV還可進一步細分為犢牛腹瀉和冬季痢疾[29]。犢牛腹瀉主要見于1～2周齡的犢牛，排出淡黃色或灰白色水樣糞便，嚴重時排出血便；腹瀉導致機體水與電解質流失，嚴重時可引起機體脫水、酸中毒[30]。牛冬季痢疾主要是成年牛于冬季發病，患病牛表現腹瀉，眼鼻分泌物增多，若泌乳奶牛感染還表現為泌乳量下降并且影響之后的生產性能。BRCoV可感染不同年齡段的牛，多見于2～6月齡的牛，臨床表現為鼻炎、流鼻涕、呼吸困難、咳嗽和發熱等，若與其他呼吸道疾病的病原體混合感染則會出現支氣管肺炎、間質性肺炎和壞死性大葉肺炎，導致病情加劇及牛群病死率增加。

4 牛冠狀病毒病診斷技術

4.1 病毒分離

一般采集病牛的糞便、血樣、鼻拭子或病死牛的遠端腸組織、肺組織等臨床樣品進行BCoV的分離，但該檢測方法存在試驗條件嚴格、操作步驟復雜和費時費力等缺點，一般不應用于臨床檢測。

4.2 免疫學檢測

4.2.1 免疫組織化學技術

免疫組化技術原理是通過熒光素、金屬離子、同位素等標記BCoV 抗原或與BCoV 相結合的特異性抗體，對病毒在組織中進行定位、定性及相對定量的檢測技術。在試驗中使用針對BCoV的高免疫抗血清或單克隆抗體進行免疫組織化學染色，以檢測冰凍或石蠟包埋的呼吸道或腸道組織中的病毒抗原[31]。但高免疫抗血清或單克隆抗體制備時間長，耗費高，不適用于大規模檢測。

4.2.2 酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）

劉合義等[32]、胡林杰等[33]、李晨露[34]建立了基于BCoV N蛋白的抗體間接ELISA，經臨床檢測，其結果與病毒中和試驗結果符合率很高。上述研究結果表明，與其他血清學檢測方法相比，ELISA的敏感性更高，操作更加簡便，更適用于大規模樣品的檢測。

4.2.3 中和試驗

病毒中和試驗是診斷BCoV 的金標準，其原理是在適當條件下使病毒與抗體相互反應，之后將混合物接種到敏感的宿主體內，再測定殘存的病毒感染力的一種方法。中和試驗具有較高的敏感性和特異性，但操作復雜，試驗要求高，耗時長，因而很少在臨床檢測中使用。

4.2.4 血凝與血凝抑制試驗

BCoV的HE蛋白能夠凝集多種動物的紅細胞，據此可通過血凝與血凝抑制試驗對BCoV進行診斷。陸承平[35]曾在BCoV的流行病學調查中應用了血凝與血凝抑制的方法進行檢樣，結果顯示，該方法的檢測結果與中和試驗、ELISA法的檢測結果相關度均較高。

4.3 分子生物學檢測

4.3.1 RT-PCR及多重RT-PCR

劉合義等[36]建立了檢測BCoV 的RT-PCR，結果顯示該方法反應速率快，特異性強，最低可檢測到1個半數組織培養感染劑量（TCID50）的病毒含量。但BCoV常與其他病毒混合感染，如牛輪狀病毒，因而生產中需要同時檢測多種病原的方法。柳強等[37]、候佩莉等[38]、季彬等[39]建立了檢測包括BCoV 的多種病毒的多重RT-PCR 方法，均具有很好的特異性和敏感性，可應用于多種病毒性疾病的快速診斷。Cho 等[40]建立了以N 基因為靶點的巢式PCR，具有較高的敏感性，最低檢出限度為2×102TCID50/0.1 mL。

4.3.2 實時熒光定量PCR

沈付嬈等[41]建立了BCoV SYBR GreenⅠq-PCR方法，最低檢測限為7.8 copies/μL，與牛主要消化道和呼吸道病毒病病原均無交叉反應，批內、批間重復變異系數均低于1.5%。譚爍等[42]建立了BCoV Taq Man qRT-PCR，對重組質粒標準品的檢測下限為33.6 copies/μL。彭志豪等[43]、劉夢瑤等[44]建立的多重實時熒光定量RT-PCR檢測方法，均具有較好的特異性、敏感性及重復性。

4.3.3 環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP 針對靶基因的6 個區域設計4 種特異性引物，通過鏈置換性DNA 聚合酶的作用下僅需數十分鐘；具有高效、方便、快速和特異性強等特點。韓廷義等[45]建立了檢測BCoV 的RT-LAMP 技術，針對冠狀病毒的N 基因設計引物，最低可檢出50 個拷貝的RNA；且完成了可視化，能夠通過肉眼進行試驗結果的觀察。隨著疾病診斷技術不斷變革，第三代PCR、微流控芯片、納米金LAMP標記技術、規律間隔成簇短回文重復序列（CRISPR）技術等技術與生產應用結合的愈加緊密。因此，在實際生產中應根據各種技術的優缺點選擇適合當時環境的方法進行檢測，以達到高效、準確和快速的目的。

5 牛冠狀病毒病治療與預防

截至目前仍沒有針對BCoV 的特定治療方法，也沒有抗病毒藥物，因此很難控制其傳播。牛冠狀病毒病的治療仍以收斂止瀉、平衡電解質、補充體液、抗菌消炎等對癥療法和支持療法為主。但最近越來越多研究發現，N蛋白是研發廣譜冠狀病毒抑制劑的潛在目標[46]，可能為BCoV 的防治提供了新方向。

對牛冠狀病毒病最主要的預防措施是注射疫苗，其目的是獲得特異性保護力。目前國外已有BCoV的商品化疫苗，如俄羅斯研制的預防新生犢牛腹瀉的四聯滅活疫苗[47]以及日本研制的BCoV滅活油佐劑疫苗等。美國輝瑞動物保健公司的Scour Guard 3（K）等滅活疫苗可以接種給妊娠后期的母牛以提高獲得性免疫水平[48]，犢牛通過吮吸初乳攝入保護性抗體，以保護犢牛免受臨床BCoV感染。也有一部分疫苗可直接作用于犢牛，通過口服的方式提升犢牛免疫力。Takamura 等[49]研發了一種由受感染細胞的可溶性細胞提取物與油基佐劑混合制成的疫苗，該疫苗抗體效價高，且尚未出現不良反應。Vega等[50]開發了一種通過口服免疫球蛋白Y（IgY）抗體產生被動免疫的新型疫苗可用于控制新生犢牛腹瀉。此外還有一種鼻內疫苗可誘導即時的先天反應產生干擾素，進而迅速起到保護作用，犢牛可適時接種減毒的鼻內活疫苗。盡管我國也有學者進行過BCoV 疫苗的相關試驗[51]，但尚無流通的國產商品化疫苗。目前對于BCoV疫苗的開發更偏向于安全、高效、成本更低的基因工程疫苗[52]。對于BRCoV相關疫苗的研究較少，也沒有商品化疫苗的存在。自從2019年新冠病毒暴發后，由CoV 導致的呼吸道癥狀引起人們的高度重視，因此今后BCoV疫苗研究也可能更注重呼吸道與腸道多毒株聯合疫苗的開發。

除了接種疫苗外，科學的飼養管理也能夠在一定程度上預防牛冠狀病毒病。如在養殖生產中使用次氯酸鈉等消毒劑對牛舍、臥床等進行嚴格消毒，加強通風與打掃，定期更換墊料。此外，注重科學飼喂，提高機體抵抗力，也可降低牛冠狀病毒病的發生概率。

6 展望

近年來，隨著BCoV的相關研究不斷深入，人們已對該病毒的基因結構、流行特性和致病機制等方面具有一定了解。但仍存在許多問題亟待解決:病毒基因組可能出現變異、重組事件，威脅人類安全；需要加強對某些蛋白功能、致病進程和免疫逃避等方面的研究；腸道型和呼吸道型BCoV的發病機制和因果關系還需繼續研究。

目前市面流通的商品化疫苗存在免疫時間短、繼發肌炎等缺點，故應加快新型疫苗的研發，如DNA 疫苗、亞單位疫苗。因此，加強BCoV的研究，完善相關疾病的防控，對保障畜牧業穩定發展具有重要意義。