豬瘟病毒快速檢測方法研究進展

申秋平，王麗群，曹 霞，莊林林

（ 江蘇農林職業技術學院，江蘇 鎮江 212400 ）

豬瘟是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。CSFV為單股正鏈RNA病毒，與牛病毒性腹瀉病毒1型（BVDV-1）和2 型（BVDV-2）、羊邊界病病毒（BDV）等同屬于黃病毒科瘟病毒屬，基因組全長約1.25 kb，編碼一個開放閱讀框，其5'和3'端各有一個非編碼區（UTRs）。CSFV目前已被分為3種基因型（1型、2型和3型）[1]，并可進一步分為11個亞型（1.1、1.2、1.3、1.4、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3 和3.4）。CSFV可引起家豬和野豬感染，并可在豬群之間快速傳播。豬瘟已被列為需向世界動物衛生組織通報的疫病，我國也將其列為一類傳染病。近年來，隨著養豬業快速發展，CSFV不斷變異，導致經典豬瘟向非典型、溫和型豬瘟等演變，同時臨床中存在多種病原混合感染，提高了臨床診斷難度。基于此，本文綜述了當前國內外CSFV 快速檢測方法的研究進展，以期為我國獸醫工作者快速精準診斷及科學防控豬瘟提供參考。

1 基于血清學的快速檢測方法

1.1 免疫層析試紙條方法

抗體檢測是目前畜禽疫病快速診斷和防控措施的重要組成部分。由于目前監測抗體（Abs）的方法費時、價格較高且需要進行細胞培養和病毒操作，Xu等[2]以CSFV E2蛋白為標記抗原開發了一種免疫層析試紙用于快速檢測CSFV Abs，該試紙檢測血清中CSFV Abs 的靈敏度可達1∶128 000，且與其他豬病毒的Abs 無交叉反應。為實現CSFV 即時檢測，Sambandam 等[3]利用CSFV 1.1 單克隆抗體開發的免疫層析方法可檢測到樣品中低至36.8 TCID50/mL的CSFV；且與PCR相比，該方法的敏感性和特異性分別為80.36%和87.10%。此外，為提高E2蛋白與CSFV抗體之間的親和力，Bai等[4]基于Bac-to-Bac桿狀病毒系統表達的重組E2 蛋白開發了免疫層析試紙法，靈敏度可達1∶102 400。

1.2 酶聯免疫吸附試驗法

酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體在載體表面進行反應的一種方法。Cao等[5]基于重組CSFV E2蛋白開發了一種固相阻斷酶聯免疫吸附試驗方法（solid-phase blocking ELISA，spbELISA）以特異性檢測豬血清中的CSFV 抗體，結果表明，spbELISA法可快速檢測接種CSFV C株的豬的抗體水平，且適用于大規模篩選。鑒于基于CSFV全長E2蛋白的ELISA無法區分抗CSFV和抗BVDV抗體，Ji等[6]構建了一種涵蓋抗原域B、C、D、A（E2B、C、D、A）的重組CSFV E2蛋白，并以此建立了一種增強的間接ELISA方法。使用該方法未觀察到抗BVDV血清的交叉反應，并顯示出較高的敏感性（93.7%）和特異性（92.3%）。

使用活體標記疫苗進行接種是有效控制疫情的重要途徑，但該方案的實施需以可區分感染動物和接種疫苗動物（DIVA）為基礎。由于保護性免疫反應的誘導多依賴針對CSFV E2蛋白的病毒中和抗體，因此優選DIVA 策略是基于對受感染豬群中Erns特異性抗體的檢測。基于此，Meyer等[7]開發了一種Erns雙抗原ELISA以區分CSFV標記疫苗和野毒株，與常規CSFV E2 抗體ELISA 相比，該方法可更早地檢測到血清中的抗體，且靈敏度和特異性分別達90.2%、93.8%。

為縮短CSFV 檢測時間并簡化步驟，Conlan 等[8]開發了一種以免疫磁珠（immunomagnetic bead，IMB）為固相載體的抗原捕獲ELISA（IMB-ELISA）方法；結果表明，IMBELISA的分析靈敏度比常規ELISA高64倍，靈敏度和特異性均為100%，該方法支持目視判斷，且比常規ELISA更易操作。此外，為實現經濟且可靠地檢測CSFV抗體，趙少若等[9]通過制備E2 蛋白單克隆抗體建立了一種CSFV 阻斷ELISA 方法。結果表明，豬瘟疫苗免疫2 周后即可使用該方法檢測到相應的抗體，且與BVDV無交叉反應。

1.3 化學發光檢測法

化學發光檢測法是基于化學反應產生的光輻射而進行分析的一種方法，具有靈敏度高、選擇性好、速度快、線性范圍寬等優點。麻園等[10]以E2蛋白為包被抗原建立了一種CSFV 化學發光抗體檢測法，該方法可在20 min內完成血清中的CSFV 抗體檢測，且具有良好的特異性和重復性。為驗證CSFV 化學發光競爭ELISA 抗體檢測試劑盒的應用效果，徐璐等[11]通過對2 200份血清樣本進行檢測，結果表明，所用試劑盒與進口試劑盒具有高度一致性，且與病毒中和試驗結果接近完全一致。

1.4 生物傳感器方法

隨著生物、物理、化學等多學科技術的融合創新，生物傳感器因其速度快、靈敏度高、特異性強等優點已越來越多地應用于病原微生物快速檢測[12]。其中，磁致彈性（magnetoelastic，ME）傳感器是基于磁致伸縮原理、利用兩個不同磁場交叉產生應變脈沖信號以測量位置的一種傳感器。Guo 等[13]利用抗CSFV IgG 構建了一種可快速檢測CSFV 的高敏ME 生物傳感器，該傳感器的諧振頻率可隨CSFV 濃度的增加而增加，檢測限可達0.6 mg/L，且在0～2.5 mg/L的范圍內共振頻率移動與濃度呈線性比例。為進一步提升CSFV檢測能力，該團隊還基于E2蛋白開發了一種無線ME生物傳感器[14]，檢測限達到2.466 μg/L，為E2抗體檢測提供新的可選工具。

2 基于核酸的快速檢測方法

2.1 基于逆轉錄PCR的方法

逆轉錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是結合RNA 的逆轉錄和cDNA 的PCR 反應的技術。目前已發表的研究主要基于CSFV 5' UTR、E2 糖蛋白基因以及NS非結構性蛋白基因等設計通用檢測及分型引物。CSFV、非典型豬瘟病毒（APPV）和非洲豬瘟病毒（ASFV）給世界養豬業造成了巨大的經濟損失。Liu等[15]建立了一種可同時檢測上述3 種病毒的多重RT-PCR 方法，該方法對ASFV、CSFV和APPV具有高特異性、敏感性和可重復性，檢測CSFV 的靈敏度為6.34×10 copies/μL。Rajkhowa等[16]建立了一種可同時檢測CSFV、豬圓環病毒2 型（PCV2）和豬細小病毒（PPV）的三重PCR 方法，該方法靈敏度可達300 pg/反應，為豬DNA和RNA病毒混合感染快速檢測提供方法參考。

巢式PCR（nested PCR，nPCR）作為PCR 的衍生技術，通過兩對引物進行兩輪PCR 反應實現對靶標高靈敏度和特異性檢測。魏淑英等[17]根據CSFV Alfort、Brescia和C株基因組序列設計兩對引物建立了一種逆轉錄nPCR（RTnPCR）方法，該方法可快速檢測待檢樣品中的CSFV。吳旭錦等[18]建立的RT-nPCR 方法檢測限達6.7×10-5ng/L。胡建和等[19]開發的nPCR 實現了CSFV、BVDV 和BDV 快速鑒別。此外，為縮短檢測時間，Barlic-Maganja等[20]通過RT-PCR擴增CSFV RNA后在微孔板中與捕獲探針雜交，并通過ELISA 對產物進行比色檢測和區分，建立的RTPCR-ELISA法比常規RT-PCR靈敏度高100倍，且具有良好的特異性。

2.2 基于熒光定量PCR的方法

熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）技術以快速、靈敏、特異等優點已廣泛應用于微生物鑒定、基因表達分析等研究。通過將RNA 先逆轉錄成cDNA 或直接在反應體系中加入逆轉錄酶，即可實現RNA 快速定量檢測。趙建軍等[21]使用CSFV 通用引物和野毒株特異性TaqMan探針，建立的qPCR方法檢測限低至10 copies/μL，并在108～101范圍內具有良好的線性關系，此外使用該方法可在表現出豬瘟臨床癥狀前3～4 d檢出CSFV。Zheng等[22]利用SYBR green I 建立的雙重qPCR 方法可同時檢測CSFV 和豬圓環病毒3 型（PCV3），并表現出較高的靈敏度、特異性和可重復性。Ning等[23]基于NS2基因建立了一種高分辨率熔解曲線分析方法，可用于同時檢測和區分CSFV 疫苗株和石門株。為加快核酸擴增及提高檢測能力，Wernike 等[24]評估了高速qPT-PCR 在檢測CSFV 中的應用性能。結果表明，高速qPT-PCR 的靈敏度為200 copies/μL，但不同PCR儀的反應時間和靈敏度略有不同。Liu等[25]基于引物-探針能量轉移建立了一種qPCR方法以用于CSFV 高效檢測。該方法檢測限可達20 copies/反應，并具有高特異性和可重復性，通過熔解曲線分析可準確區分CSFV野毒株和疫苗株。

為優化逆轉錄反應以提高RT-qPCR 的靈敏度，Podgórska等[26]通過比較不同的逆轉錄酶、熱條件和引物組合，發現使用SuperScript Ⅱ酶、非酰胺和反向、基因特異性引物可獲得最佳的逆轉錄效果。與使用AMV酶與隨機六聚體的方法相比，該組合可將RT-PCR 的靈敏度提高近1 000 倍。此外，為便于快速采樣，Petrini 等[27]通過采集感染后不同時間的口腔液和血清進行檢測，結果表明使用RT-qPCR 可從口腔液中檢測到CSFV 的概率與血樣相同甚至更高。為進一步簡化樣本處理過程，Nishi等[28]開發了一種免核酸提取的多重RT-qPCR 以同時檢測ASFV、CSFV和豬內源基因，使用血清和組織勻漿作為樣本時，該方法均顯示出良好的敏感性和特異性。考慮到5' UTR 作為CSFV檢測單一靶標的局限性，Leifer等[29]使用NS5A基因作為靶標，并與β-肌動蛋白檢測系統聯用建立了一種RT-qPCR 方法。試驗結果表明，該方法檢測結果可靠且獨立于5' UTR，為CSFV精準檢測及實驗室排除5' UTR擴增產物污染提供了工具支持。

2.3 環介導等溫擴增方法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP 是2000 年由Notomi 等[30]發明的一種核酸擴增技術。該技術的特點是針對靶基因的6個區域設計4條擴增引物（其中兩條為長引物），在鏈置換DNA 聚合酶的作用下，60～65 ℃、60 min 內可擴增出109～1010個靶序列，具有擴增效率高、支持目視判斷等優點。Chen 等[31]基于CSFV 5' UTR開發的RT-LAMP 方法可在65 ℃、60 min內完成檢測，該方法檢測限可達5 copies/反應，并顯示出比RT-PCR 和病毒分離更高的檢測率。Yin 等[32]建立的RTLAMP 方法可在50 min 內完成CSFV 檢測，且靈敏度和實際檢測性能均優于常規RT-PCR。

為實現LAMP 結果可視化，Zhang 等[33]在反應體系中加入SYBR Green I，可根據反應前后顏色變化進行判斷，并實現與RT-qPCR 相當的檢測性能。Zhang 等[34]應用SYBR Green I 建立的可視化LAMP 方法靈敏度達5 copies/反應，并可特異性檢測CSFV疫苗株（HCLV）。此外，鑒于免疫層析試紙條簡單、快速、現場檢測等優勢，Chowdry 等[35]結合LAMP 與免疫層析試紙建立了一種可用于CSFV 快速檢測的方法，使用試紙可在2～5 min 內讀取擴增結果，分析靈敏度約為100 copies/反應。

2.4 基于重組酶的核酸擴增方法

重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）是近年來發展的一種核酸等溫擴增技術，可在37～42 ℃恒溫條件下實現對靶序列快速擴增，具有反應條件溫和、擴增效率高等優點。楊俊等[36]基于CSFV 5'端UTR 設計引物和exo 探針，建立的實時熒光RPA 方法可在30 min 內完成CSFV 檢測，針對CSFV 重組質粒的檢測限為8.3×102copies/μL，且具有良好的特異性。Tu 等[37]開發了一種基于熒光探針的實時反轉錄重組酶介導核酸擴增方法（real-time reverse transcription recombinase-aided amplification，rRT-RAA），該方法對CSFV 表現出良好的特異性和可重復性，靈敏度達2 TCID50/反應，與RT-qPCR 方法的重合率為98.5%。同時，rRT-RAA結果可通過藍光成像儀直接肉眼觀察。

為區分CSFV 野毒株和疫苗株，Zhang 等[38]聯合RTRAA 和CRISPR/Cas13a 建立的快速診斷方法檢測限可達3.0×102copies/μL。同時，通過引入加熱未提取的診斷樣品以滅活核酸酶處理方法，敏感性比抗原ELISA 高100倍。薛俊欣等[39]基于Cas13a建立的RAA-Cas13a方法將檢測靈敏度提高至102copies/μL，并具有良好的特異性和可重復性。

2.5 微陣列方法

基因微陣列是近年來發展的一種分子技術，可通過成千上萬個DNA 片段密集排列于硅片、玻片或尼龍膜等固相載體上，在特定條件下與樣品靶序列雜交，通過熒光顯微鏡等設備獲取圖像后進行信息分析，該技術具有高效率、高通量等優勢，適于大規模檢測。Xia等[40]開發了一種基于四重PCR的微陣列方法，可一步法區分CSFV野毒株和疫苗株、ASFV 以及APPV；該方法對CSFV 野毒株和疫苗株的檢測限分別為6.98 和6.92 copies/μL。為快速準確鑒別CSFV 的3 種基因型，Kim 等[41]開發了一種CSFV DNA芯片方法，擴增產物與芯片上的探針進行雜交后通過熒光掃描進行檢測；該方法檢測限可達1 TCID50/100 μL，且檢測結果與序列分析結果一致。為實現多重檢測，王溫田等[42]將生物素標記PCR 產物后與基因芯片進行特異性逆向點雜交，通過芯片掃描實現對病原的檢測和分析。結果表明，目標核酸與芯片雜交后可顯示明顯的陽性信號，且重復性良好。

2.6 其他快速檢測方法

絕緣等溫PCR（insulated isothermal PCR，iiPCR）是利用反應容器下的單一熱源，通過瑞利-貝納德對流產生溫度梯度的一種PCR 方法。Lung 等[43]基于逆轉錄iiPCR（iiRT-PCR）技術，采用POCKIT?核酸分析儀檢測來自目標特異性熒光標記探針的光學信號，實現對CSFV 高靈敏度和特異性的檢測。此外，iiRT-PCR 法可從病毒接種2 d后的血清中檢出CSFV，顯示出其具有早期診斷應用價值。

G-四聚體DNA 酶已成為可視化DNA 檢測的重要可選工具。Lu 等[44]聯合比色G-四聚體DNA 酶與依賴核酸序列的擴增方法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）建立了一種可目視檢測CSFV 石門株和HCLV 株的方法，該方法可在3 h 內檢測到血清中低至10 copies/mL 的CSFV。隨著RNA 原位雜交方法的發展，病毒RNA 分子在培養細胞或組織切片中的定量、定位和可視化成為研究致病性的重要手段。Zhang 等[45]設計CSFV 和β-actin 探針，建立了一種RNA 原位雜交方法可監測RNA 在感染細胞中的相對位置，該方法可特異性檢測CSFV 1.1、2.1、2.2 和2.3 亞型，且最早可在感染后0.5 h檢測到病毒RNA。此外，為提高CSFV檢測效率并簡化步驟，Ning 等[46]設計了一種DNA 序列共軛修飾的金納米（CSFV-AuNP）探針以實時檢測CSFV，修飾的DNA 序列能夠特異性識別和捕獲CSFV RNA 并產生熒光信號以實現定量分析。

3 展望

鑒于目前豬瘟越來越多地表現為非典型、溫和型以及混合感染等復雜形式，實驗室檢測已成為豬瘟確診的重要輔助手段。多種檢測方法中，病毒分離培養結果準確，但煩瑣費時，難以滿足病原確認的時效性需求。基于免疫學和核酸的檢測方法具有方便快速、方案設計靈活多樣等優勢，已成為常用的CSFV檢測方法，但免疫學檢測方法敏感性有待提高，且具有一定的滯后性。基于核酸的檢測方法快速、靈敏、特異，且病毒核酸可以在宿主感染后更早地被檢測到，但目前以PCR為代表的核酸技術或依賴存在安全威脅的電泳試驗，或需使用成本較高的試劑及儀器，難以推廣至資源條件有限的用戶。等溫擴增技術為核酸檢測提供新的工具支持，但目前在引物（探針）設計、反應體系成熟度等方面仍存在一定局限性，且綜合性能（包括靈敏度、特異性及可重復性等）仍有待提升。隨著多學科技術的發展與融合創新，期待未來能夠出現更多簡單快速、成本可控且用戶友好的新興技術以更好地滿足即時檢測、欄邊檢測以及超多重檢測等多樣化需求。