檸檬酸對苜蓿干草捆營養品質與霉菌數量的動態影響

楊燕燕， 孫 宇， 吳春會， 李運起， 趙 超， 李秋鳳， 王明亞

(河北農業大學動物科技學院， 河北 保定 071000)

苜蓿產量高，營養豐富，享有“牧草之王”的美譽，是反芻家畜粗飼料的重要來源之一[1]。為緩解一年四季中飼草供應不均衡的問題，苜蓿主要利用方式為調制成干草貯藏使用。已有研究表明現蕾期的苜蓿干草的粗蛋白含量在20%以上、胡蘿卜素含量為140 mg·kg-1以上，粗纖維含量為30%以下[2]。干草捆因具有體積小和便于運輸的優點，成為苜蓿干草運輸貯藏的主要方式[3]。苜蓿干草捆的營養品質受調制過程的影響，調制過程中，苜蓿鮮草的干燥時間不夠導致水分含量較高[4]，再加上苜蓿收獲季節多為梅雨季，空氣濕度較大[5]，霉菌大量繁殖，造成營養品質下降。此外，苜蓿草捆在收割時會攜帶田間真菌，且貯藏期間的干燥和性pH環境中也會使干草捆被霉菌污染[6]。同時，一些真菌物種可以產生大量的真菌孢子，這些真菌孢子就會通過空氣在干草捆中傳播[7]。霉菌大量增殖的代謝產物——霉菌毒素，會嚴重威脅到畜禽的機體健康與畜產品安全[8]。因此，在貯藏期間減少飼草霉變的發生，成為了亟待解決的難題。

干草防霉劑能有效減少貯藏期間霉菌的增殖，如有機酸及其鹽類與生物制劑，其中檸檬酸能直接被生物體吸收代謝，且無殘留、無抗藥性、無毒副作用，其作為綠色添加劑在畜牧業已得到廣泛應用。大量研究表明檸檬酸具有提高畜禽的生長性能、降低死亡率、提高免疫力，改善腸道健康、改善青貯的營養品質與發酵特性的功能[9-14]。此外，檸檬酸作為防霉劑已廣泛被應用于食品添加中，不僅能調整食品的風味，還可以對某些微生物的生長起到良好的抑制作用，進而起到防止食品變質的作用[15-16]。畜牧業中也有研究證明在配合飼料中添加0.5%～5%的檸檬酸,能有效抑制微生物的增殖及毒素的產生，減少貯存期間營養品質的損失，從而保證飼料質量，減少浪費[17]。作用機理是其可以在飼料的表面形成一層均勻的有機酸的保護膜，且檸檬酸能顯著降低飼料的pH值至霉菌無法增殖，從而達到抑菌的作用[18]。將4%的檸檬酸添加至乳酸菌發酵飼料中，與對照組相比，可減緩霉變情況的發生[19]。葛文霞[20]發現在TMR顆粒飼料中添加防霉劑的防霉效果為：2%檸檬酸>1%檸檬酸>0.5%檸檬酸。然而，關于檸檬酸在畜牧業的研究大多數是體內試驗，很少有人研究檸檬酸在體外的防霉防腐效果。本研究通過在苜蓿干草中添加不同水平的檸檬酸，研究貯藏期間苜蓿干草的營養品質與霉菌數量的動態變化，探究其防霉效果及確定最佳用量，旨在探討檸檬酸的體外防霉效果并以期提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自河北省滄州市海興縣2021年9月收獲的第三茬‘中苜二號’紫花苜蓿(現蕾期，種植第三年)。

1.2 試驗方法

試驗采用單因素完全隨機設計，試驗處理分別為：CK，為不添加防霉劑處理；N1為添加1%檸檬酸處理；N2為添加2%檸檬酸處理；N3添加3%檸檬酸處理，每個處理設置3個重復。用2.5 L噴壺將提前配制好的檸檬酸水溶液(將不同量的檸檬酸溶于同量的蒸餾水中)均勻噴施于翻曬后的草條上(草條厚度約為0.1 m，含水量為22%～25%)，自然晾曬3小時左右，至含水量20%時，通過打捆機(打捆機型號為：MASSEY FERGUSON 9YF-1.92(1 840))打成小方捆，草捆長0.8 m，寬0.35 m，高0.3 m，打捆密度為178 kg·m-3。將打捆后的苜蓿草捆中每3捆無規則地堆成草垛，放置于通風良好的草棚內貯藏。試驗共分為四個處理組，貯藏期從2021年9月17日到2021年11月17日，貯藏20，30，40，50與60 d環境中的平均溫度分別18.40℃，12.20℃，9.60℃，11.70℃與5.60℃；相對濕度分別為85.81%，71.00%，75.60%，85.09%與62.00%，分別在貯藏的第0 d，20 d，30 d，40 d，50 d，60 d用電動取樣器在草捆的4個面分上、中、下3層取樣，每層取4個樣，每個草捆的48個樣混合均勻，帶回實驗室，取10 g用于測定霉菌數量，剩余部分測定常規營養指標。

1.3 試驗指標及測定方法

1.3.1常規組分測定方法 飼料中水分測定采用GB/T6435-2014測定；粗脂肪(EE)參照GB/T6433-2006進行測定；粗蛋白(CP)參照GB/T6432-2018進行測定；粗灰分(Ash)參照GB/T6438-2007測定；中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)分別參照GB/T20806-2006、NY/T1459-2007用美國ANKOMA2000i全自動纖維儀進行測定；可溶性糖(WSC)采用蒽酮-硫酸比色法測定。

相對飼喂價值(RFV)代表反芻動物對可消化干物質(DDM)的隨意采食量(DMI)，DDM和DMI通過粗飼料的NDF和ADF值計算。計算公式如下：

RFV=DMI×DDM/1.29

DMI=120/NDF

DDM=88.9-0.779×ADF

1.3.2霉菌數量測定方法 按GB/T13093-2006規定方法測定飼料中霉菌數量。

1.3.3隸屬函數評價 采用隸屬函數評價法對苜蓿草捆不同處理的各個指標進行評價，得出最佳施用量。

計算公式為：UX(+)=(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)；UX(-)=1-UX(+)。

式中：UX(+)為各指標呈正相關隸屬函數值，UX(-)為各指標呈負相關隸屬函數值。Xij為某樣品某指標測定值；Ximax為某樣品某指標最大測定值；Ximin為某樣品某指標最小測定值。

1.3.3數據分析 利用Excel 2019進行數據錄入處理，用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析，用Duncan方法對數據進行多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 添加檸檬酸對苜蓿草捆營養品質的影響

相同處理下，不同的貯藏時間，苜蓿草捆的CP含量有一定的差異(表1)。貯藏期間內，各組的CP含量隨著貯藏時間的延長呈逐漸降低的趨勢(P<0.05)。相同的貯藏時間不同處理間的CP含量存在差異。貯藏30，40與60 d時，N2與N3組的CP含量顯著高于CK組(P<0.05)，貯藏50 d時，N3組的CP含量顯著高于其他組(P<0.05)。隨著貯藏時間的延長，CK組的EE含量顯著降低(P<0.05)，檸檬酸處理的EE含量差異不顯著。苜蓿草捆貯藏60 d時，CK組的EE含量顯著低于其他3個處理組(P<0.05)；貯藏期間內，同一貯藏天數不同處理組之間的EE含量差異不顯著。隨著貯藏時間的延長，苜蓿草捆的WSC含量顯著降低(P<0.05)；與第0 d相比，貯藏60 d時，CK，N1，N2與N3組的WSC含量分別降低了25.36%，18.27%，24.34%與14.50%。貯藏期間內，相同的貯藏時間不同的處理之間WSC含量差異不顯著。總體而言，隨著貯藏時間的延長，各組的NDF含量呈逐漸增加的趨勢。相同貯藏時間，不同處理間的NDF含量差異顯著(P<0.05)。N3組貯藏20與30 d時的NDF含量顯著低于其他3個處理組(P<0.05)；貯藏50與60 d時，檸檬酸處理的NDF含量顯著低于CK組(P<0.05)。隨著貯藏時間的延長，各組的ADF含量呈逐漸增加的趨勢。相同貯藏時間不同處理的ADF含量差異顯著(P<0.05)。貯藏20 d～40 d時，N2與N3組的ADF含量顯著低于N1與CK處理組(P<0.05)；貯藏50 d時，N2與N3組的ADF含量顯著低于N1組(P<0.05)；貯藏60 d時，N3組的ADF含量顯著低于其他組(P<0.05)。總體而言，貯藏期間內不同處理的Ash含量差異不顯著。

相同處理不同貯藏時間的苜蓿草捆的RFV差異顯著(P<0.05)。隨著貯藏時間的延長，各處理的RFV顯著降低(P<0.05)。貯藏20 d時，N3組的RFV顯著高于其他組(P<0.05)；貯藏30與50 d時，檸檬酸處理的苜蓿草捆的RFV顯著高于CK組(P<0.05)；貯藏40與60 d時，N2與N3組的RFV顯著高于CK與N1組(P<0.05)。

2.2 添加檸檬酸對苜蓿草捆霉菌數量的影響

貯藏過程中霉菌數量的變化如表2所示。貯藏期間內，隨著貯藏時間的延長各組的苜蓿草捆霉菌數量呈先上升再下降的趨勢。與第0 d相比，各組均在貯藏20 d時霉菌數量顯著升高(P<0.05)，且達到最大值。與貯藏40 d相比，CK、N2與N3組的霉菌數量在貯藏50 d時，顯著增加(P<0.05)。與貯藏50 d相比，貯藏60 d時，CK與N3組的霉菌數量顯著降低(P<0.05)。貯藏20 d時，相同貯藏時間不同處理的霉菌數量差異不顯著。貯藏至30 d時，N2與N3組的霉菌數量顯著高于CK與N1組(P<0.05)；貯藏40～60 d時，檸檬酸組的霉菌菌落數顯著低于CK組(P<0.05)。

2.3 隸屬函數評價

將各處理具有差異性的5個指標進行隸屬函數分析，其中粗蛋白質(CP)與可溶性碳水化合物(WSC)為正向指標，中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、霉菌數量為負向指標(表3)。平均5項指標的隸屬函數值進行綜合價值的排序，平均值越大綜合價值越高。貯藏20與40 d時，各處理綜合價值排序為N3>N2>N1>CK；貯藏30，50與60 d時，各處理綜合價值排序為N3>N2 >CK>N1。

表1 不同處理對苜蓿草捆營養品質的動態影響Table 1 Dynamic effects of the different treatments on the nutritional quality of alfalfa bales 單位：% DM

表2 不同檸檬酸處理對苜蓿草捆霉菌數量的影響Table 2 Dynamic effects of different treatments on the amount of molds in the alfalfa hay bales 單位：104cfu·g-1

表3 隸屬函數評價不同檸檬酸處理對苜蓿草捆綜合價值的影響Table 3 Evaluation on the quality of alfalfa hay bales with different treatments at different storage days using membership functions

3 討論

3.1 檸檬酸對苜蓿草捆營養品質的動態影響

貯藏過程中，植物的呼吸作用占據主導地位，營養物質向著分解的方向進行，多糖降解為單糖，蛋白質被水解為多肽、氨基酸等小分子物質，釋放能量來維持其生理生化活動，且微生物能將苜蓿草捆中的大分子物質(淀粉、纖維素、蛋白質和脂肪等)水解為可溶性的低分子物質吸收到細胞內加以利用，使飼草的營養品質隨著貯藏時間的延長逐漸下降[21]。本研究中，隨著貯藏時間的延長，CP含量、WSC含量與RFV呈逐漸降低的趨勢，NDF與ADF的含量呈逐漸升高的趨勢。本研究結果與孫雷雷等[22-24]研究結果一致，原因可能是較長的貯藏時間需要更多的底物和能量去維持微生物生長繁殖的需要，也可能是貯藏期間營養物質能通過呼吸作用被分解為水和二氧化碳[25-26]，使營養品質隨貯藏時間延長呈逐漸降低的趨勢。

酸性添加劑能加速飼草的酸化，抑制蛋白等營養物質的降解和有害微生物的活動[22-23]，進而減緩營養物質的損失。本研究中苜蓿草捆中添加2%與3%檸檬酸后，貯藏30，40與60 d時的CP含量、貯藏40 d與60 d的RFV含量均顯著高于對照組。原因可能是檸檬酸在飼草表面形成一層均勻的保護膜，且作為酸化劑能顯著降低飼草pH，導致腐敗真菌無法生存，霉菌數量降低，營養品質的損失量減少。研究報道稱檸檬酸能抑制青貯過程中的蛋白降解，且檸檬酸的酸化能力，能破壞完整穩定的細胞壁結構，降低青貯后的纖維含量，RFV得到提高[20]，與本研究結果一致，這說明檸檬酸不僅能作用于青貯飼料，在干草中同樣適用。

3.2 檸檬酸對苜蓿草捆霉菌數量的動態影響

霉菌數量能直觀反映苜蓿草捆貯藏過程中是否發生霉變。本研究中霉菌數量均在貯藏20 d時達到最大值，之后逐漸降低，此變化規律與孫雷雷等[33]研究結果一致。原因可能是苜蓿刈割時會攜帶大量的田間真菌，打捆后苜蓿草捆中的真菌大肆生長，同時伴有植物呼吸作用，微生物就會大量繁殖、產熱，使苜蓿草捆中的溫度達到小高峰，之后由于草捆中的溫度較高已不適于霉菌的生長，再加上貯藏環境的溫度逐漸降低，均使草捆中的霉菌數量逐漸減少[34]。本研究中，添加2%與3%檸檬酸的苜蓿干草與貯藏30～60 d的霉菌數量顯著低于對照組，說明2%與3%檸檬酸能顯著抑制霉菌的增殖。王文娟[35]發現，在飼料中添加0.5%～5%檸檬酸能降低飼料的pH，抑制微生物的增殖，與本研究結果一致。

3.3 隸屬函數評價檸檬酸對苜蓿草捆綜合價值的影響

各處理在不同指標上表現均不相同，因此，以任何一個單一指標評價均是不全面的[36]。CP，WSC，NDF，ADF與霉菌數量是反映苜蓿草捆營養品質的重要指標，將平均5項指標的隸屬函數值進行綜合價值的排序，平均值越大綜合價值越高。本研究中相同的貯藏時間內3%的檸檬酸處理后的苜蓿草捆綜合價值最優，說明3%檸檬酸能顯著減緩苜蓿草捆的營養品質下降的速率。

4 結論

隨著貯藏時間增加，苜蓿干草捆的WSC，CP，RFV呈逐漸降低的趨勢，NDF與ADF呈逐漸增加的趨勢。添加2%與3%檸檬酸能顯著降低苜蓿干草捆貯藏30，40與60 d的CP含量，顯著增加苜蓿干草貯藏30～60 d的RFV，其中將3%檸檬酸添加至苜蓿干草中，效果最佳；貯藏期間內，隨著貯藏時間的推移，苜蓿干草捆的霉菌數量呈二次增長變化趨勢，貯藏30～60 d時，2%與3%檸檬酸能顯著抑制霉菌數量的生長；從隸屬函數評價分析來看，相同貯藏時間內，苜蓿干草中添加3%檸檬酸后的綜合價值最高。