百蕊草擴繁和栽培利用研究進展

高佳慧， 張曉明， 唐 芳

(內蒙古農業大學草原與資源環境學院， 內蒙古 呼和浩特 010010)

百蕊草(ThesiumchinenseTurcz.)，又名百乳草、地石榴、細須草等，屬檀香科百蕊草屬植物，為多年生半寄生草本植物[1]。百蕊草廣泛分布于世界各地，在我國西南、華南、華中、華北、東北及西北地區均有分布，多生于潮濕地帶或草甸、沙漠等邊緣地帶[2]。百蕊草是我國重要的藥用植物，味微苦、性寒[3]，具有清熱解毒、抗菌消炎、補腎澀精等功能，常被用來防治發炎、流感發熱及各類急性炎癥等[4]，故有“植物抗生素”的美譽，在我國中藥材市場具有極高的市場價值和需求度。近些年，由于人們的過度采收、人類活動的加劇和生態環境的惡化，造成全國范圍內百蕊草植株急劇減少，甚至在某些生態區消失，嚴重削減百蕊草產量。然而，藥材廠商對百蕊草的需求卻日益增多，供需矛盾更顯突出。為滿足百蕊草的市場需求，采取人工栽培以及組織擴繁等方式來提高百蕊草產量已迫在眉睫。但是，目前針對百蕊草的研究大多數集中在有效化學成分及藥材品質方面，在人工栽培、快繁及育種等方面的研究相對較少，無法為百蕊草產業的快速可持續發展提供強有力的理論和技術支撐。

近年來，國家藥品監督管理局等部門頒布《全國道地藥材生產基地建設規劃(2018—2025年)》和《中藥材生產質量管理規范》[5]，明確了中藥材人工種植的意義及產品質量保證規范；國家林草局等部門頒布《林草中藥材野生撫育通則》《林草中藥材生態種植通則》和《林草中藥材仿野生栽培通則》等文件[6]，重點強調擴大中藥材種植途徑及建立相應種植規范。因此，在國家政策和市場需求的引導下，本文梳理百蕊草寄生生物學特性、實生植株的生長、組織培養快速繁殖、栽培利用及相關基礎研究進展，探討適宜百蕊草特殊型的栽培利用模式的可行性，為擺脫對野生百蕊草的資源依賴，擴大藥材資源供給，實現百蕊草藥用資源的可持續利用提供新思路。

1 百蕊草研究趨勢分析

對百蕊草的研究自上世紀70年代起，幾乎都集中在中藥材應用方面，以及為數不多的化學成分研究。通過對中國知網所有有關百蕊草文獻的整理與統計發現，直到2002年李育智[7]等對百蕊草中山奈酚的成分進行分離與鑒定，在隨后幾年間引來一些學者對其主要化學成分、提取工藝進行研究，但仍未形成較大規模。自2007年開始刊出對百蕊草種子內源抑制物的研究報道，2012年起對其種子方面的研究論文開始不斷增加。此外，劉永松等[8]在2006年和陳培玉等[9]在2020年針對百蕊草生物、化學、藥理等方面的研究進展進行了綜述。由圖1可知，自2011年開始出現有關百蕊草種子及組培方面的研究論文，至2016年相關論文數量呈大幅增長，表明關于百蕊草種子、組培體系的研究已逐漸被重視，構建完善的百蕊草組培體系和栽培體系將成為今后研究的熱點內容。

圖1 百蕊草發表論文數量分析Fig.1 Analysis on the number of papers published about Thesium chinense Turcz.注：圖中各時間段論文數為自1972年起至今，所有百蕊草相關文章發表數量Note:The number of papers in each period in the figure is the number of all thymoscope-related papers published since 1972

2 百蕊草生物學特性研究進展

中國植物志等文獻記載百蕊草為多年生草本植物。宋玲珊等[10]通過連續多年觀察百蕊草植株個體的生長發育，未發現可存活2年以上的植株，表明百蕊草在長江中下游地區為二年生冷季型草本植物。其余大部分地區都是一年生個體。目前，關于百蕊草其他分布區生活型的研究未見深入報道。未來需對不同氣候帶系統的生活型進行觀察研究，為百蕊草人工種植適宜區域的選擇、不同氣候帶種植模式和栽培方式的優化提供參考依據。

宋玲珊[10]、張曉明[11]等學者通過對百蕊草的物侯期進行觀察，發現自然條件下百蕊草實生苗出苗期為4—7月、營養生長期為7月、休眠期自8月下旬開始；百蕊草生長第1年根頸處不分枝，越冬休眠過程中開始發育根頸芽。翌年早春迅速發育，營養生長期為2月下旬—3月中旬，4月開始進入花果期，果實成熟后根不能正常休眠，腐爛而死。由于百蕊草具有休眠特性且生長周期較短，故宿根苗通常會在4月底進入枯萎階段，實生苗也會在大約在6月底枯萎[12]。百蕊草在休眠期前后生物量的差異較大，株型也有不同程度的差別。探究百蕊草休眠時的生理特征、觀察百蕊草的生長周期，可為人工栽培百蕊草提供科學準確的理論依據，為提高百蕊草產量和質量奠定基礎。

百蕊草寄主廣泛，包括大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)、苜蓿草(LotuscorniculatusL.)、白茅(Imperatacylindrica(L.) Beauv.)、夏枯草(PrunellavulgarisL)、牡蒿(ArtemisiajaponicaThunb.)、加拿大一枝黃花(SolidagocanadensisL.)、狗牙根(Cynodondactylon(L.) Pers.)、白茅(Imperatacylindrica(L.) Beauv.)、小麥(TriticumaestivumL.)等，共有11科28種植物[13]。百蕊草寄生于豆科植物時生長健壯、果實較大，但通常情況下更喜歡寄生于禾本科植物[14]。由于百蕊草屬于半寄生植物，其維持植物生長發育所必需的水分全部取自于寄主，因此合適的寄主能夠提高其存活率、改善其營養狀況[15]。研究表明寄主植物會顯著促進百蕊草的生長發育[16]，且不同寄主植物對百蕊草的生長發育和藥材各活性成分含量產生顯著影響。通過對不同寄主進行綜合評比，結果表明生產百蕊草藥材的優良寄主為鼠曲草(GnaphaliumaffineD. Don)、白茅和夏枯草。

百蕊草側根生長多個圓球形吸器，可刺入寄主根皮層至髓部與導管融合，以奪取寄主水分和養分[17]。劉波等[18]利用GC-MS法鑒定百蕊草寄主-夏枯草的根系分泌物成分，研究其對百蕊草吸器的誘導作用，發現2,6-二甲氧基-對苯醌(DMBQ)可誘導百蕊草根系產生吸器。但是吸器的形成機制以及吸器在寄生行為中的具體作用未見深入報道。百蕊草的吸器形成及寄生行為與寄主物種、根系空間距離、相互作用強弱有關，該特性的深入了解對人工栽培百蕊草的過程中選擇偏好性強、具有經濟價值的寄主，提高種植效率具有指導意義。

3 百蕊草種子研究

3.1 百蕊草種子休眠特性

植物的休眠是植物在生長發育過程中生長或代謝出現停止的現象，存在于大多數植物。種子的萌發過程中，探究打破休眠的影響規律，能過有效促進種子萌發[19]。在通常情況下，當種子進入休眠狀態后需經過1個季節才能萌發，并且極易在休眠期間喪失活力。百蕊草種子存在休眠特性，且萌發率較低，研究發現其浸提液能夠使小麥種子萌發率顯著下降[20]，表明百蕊草種子中的內源抑制物具有很強的生物活性，可抑制種子萌發。探究打破百蕊草種子休眠的方法，探尋合適的外源添加物，對延長百蕊草生長周期、提升種子萌發率、提高實生苗成活率具有重要意義。

3.2 百蕊草種子休眠的研究進展

為破除百蕊草種子休眠，揭示百蕊草種子休眠的機制，已有多位科學家進行了相關研究。羅夫來等[21]對百蕊草種子適宜萌發條件進行研究，發現在黑暗環境下，20℃～25℃能夠有效促進百蕊草種子萌發。通過采用GA3處理與低溫層積相結合的方法，測定百蕊草種子層積前后的糖含量、激素含量和含水量，運用高效液相色譜法分析破除種子休眠過程中的百蕊草生理變化，表明破除百蕊草種子休眠的最佳處理方法為：流水沖洗24 h后在500 mg·L-1GA3中浸泡24 h，再用低溫層積處理150～180 d。利用赤霉素處理百蕊草種子，除可打破休眠外，還可使種子萌發提前，有效提升發芽率[22]。張成才等[23]通過試驗得出相同結果。

張成才等[24]研究了不同激素及抑制劑對百蕊草種子休眠的影響。通過測定不同濃度的赤霉素(GA3)、乙烯利(ETH)、氟啶酮(FL)、油菜素內酯(BRs)浸泡百蕊草種子24 h后的裂殼率和發芽率，表明300 μmol·L-1ETH處理可有效提高種子發芽率，使得百蕊草種子裂殼率增加至43.43%、發芽率增加至83.5%，有效的解決了人工栽培百蕊草中種子萌發率低的問題。張成才等[25]研究了0，30，60，90，120 d 5個不同的變溫層積處理，并測定每個處理下種子的酶活性、激素含量變化以及發芽率，結果表明破除休眠的最佳時間點是變溫層積120 d，此時的酶活性逐漸升高，種子內營養物質和GA3，ABA向生理成熟狀態轉化。

4 百蕊草的組織培養及快速繁殖研究

4.1 構建百蕊草組培體系的必要性

植物的組培技術又稱為離體培養，通過消毒、殺菌、篩選適宜培養基以及適當的植物激素，在無菌條件下對植株各部分組織進行培育，以此產生愈傷組織，再分化形成再生植株。目前，國內外對植物組織培養的應用研究已擴大到單倍體育種、細胞育種、胚胎育種等方面，并獲得了較多研究成果[26]。植物組織培養不僅可以解決遠緣雜交中不親和性障礙問題，還能夠通過培養得到單倍體及其他多倍體。此外，利用植物組織培養方式大規模生產植物次生代謝產物，已成為生產一些植物源藥劑的重要途徑。

袁藝等[27]在2002年對野生百蕊草與其組培苗中山萘素含量進行研究，結果顯示二者山萘素含量相差不大，且發揮藥效基本一致。隨后袁藝等[28]對百蕊草野生與組培苗進行了抑菌抗炎的研究，結果表明不論是野生百蕊草，還是組培百蕊草的抑菌和抗炎作用幾乎相等。可見，百蕊草組培苗可以代替其野生品種。因此構建完善的百蕊草組培體系十分重要，為大規模生產百蕊草提供依據，緩解市場需求，實現其野生資源的替代。

百蕊草組織培養可通過愈傷組織培養、叢生芽誘導和生根培養等系列過程獲得大量植株，是實現百蕊草規模化種植和可持續開發利用的關鍵技術。目前國內外已有一定數量的學者對百蕊草組織培養進行了研究，但總體上存在著誘導率低、實驗周期長、擴繁系數低等問題，迫切需要建立穩定、高效的百蕊草離體培養技術。

4.2 百蕊草組織培養研究進展

目前我國對百蕊草組培快繁方面的研究主要集中在外植體選擇、外植體消毒時間、不同培養基的激素配比及濃度、不同外援添加物及濃度等對百蕊草組織培養體系的影響。相關成果歸納總結于表1中。

在進行組培實驗時，目前的相關研究大多選取百蕊草的莖和葉作為外植體。劉向陽等[29]在對外植體消毒時，首先將葉片經自來水沖洗干凈后用0.1%的氯化汞溶液消毒5～8 min，再用無菌水沖洗3次。吳峰等[30]則采用：75%酒精浸泡10 s，無菌水清洗2次。再用0.1%的升汞溶液消毒5 min，無菌水浸洗3次后，再用無菌水浸泡10 min，清洗2次。黃浩等[31]的消毒方式為：流水沖洗2 h，然后用洗衣粉水和低濃度84消毒水的混合液浸泡5 min，并同時用毛刷輕輕地刷洗芽基部，之后用流水沖洗5 min。羅查梅等[32]經過相關實驗得出最佳消毒方式為：先用流水沖洗凈，再用75%酒精溶液涮洗10 s，后用無菌水洗1～2次，再置于0.1%氯化汞溶液中浸泡8 min，之后統一用無菌水清洗4～5次。

由于實驗目的、消毒方式、激素選擇的不同，所得出的最佳誘導培養基的配方也存在差異。為了探究不同激素對百蕊草愈傷組織產生的影響，劉向陽等通過在基礎培養基中添加不同濃度的6-BA，NAA和2,4-D，連續培養30 d后測定愈傷組織鮮重、增重及增殖率，最終得出百蕊草愈傷組織誘導的最佳培養基。有研究者設置了4種不同激素濃度的MS培養基，經過60 d后統計分析誘導率，得出最適培養基配方為MS+1.0 mg·L-12,4-D。通過研究不同濃度和種類的激素配比，確定MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA為愈傷組織最適誘導培養基。此外，在對百蕊草離體快繁體系技術優化的實驗中，通過將6-BA濃度設置為7個不同梯度，得出結論MS+2 mg·L-16-BA+0.13 mg·L-1NAA為最適誘導愈傷培養基。

羅查梅等通過將愈傷組織轉接到不同6-BA和NAA配比的MS培養基中，培養30 d后得到最適叢生芽培養基為MS+1.5 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA。趙維萍等[33]為了研究噻苯隆(TDZ)對百蕊草叢生芽誘導的影響，將百蕊草愈傷組織接種于不同濃度的TDZ培養基中，培養30 d后發現MS+1.5 mg·L-1TDZ為最適誘導叢生芽培養基；在進行誘導生根實驗時，確定最適生根培養基為加入60 mg·L-1ABT生根粉，浸泡1 h。江芹等[34]通過誘導叢生芽和生根實驗，發現誘導叢生芽的最佳培養基是MS+1.5 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-12,4-D；此外，添加60 mg·kg-1ABT可使生根率達到76.6%。

黃燕芬等[35]為了建立百蕊草懸浮細胞培養體系，探究了不同營養物質對該體系的影響。通過選取生長度相似的淡黃色百蕊草的愈傷組織為材料，接種于配置好的液體培養基中，設置pH值濃度為5.7～5.9，在溫度為24℃、轉速115 r·min-1條件下暗培養3天后轉為弱光培養。研究表明最適于百蕊草細胞的懸浮培養條件為以MS為基本培養基，70 mmol·L-1的氮濃度，1.3 mmol·L-1的磷酸鹽濃度。

在百蕊草愈傷組織培養影響因素的相關研究中，通過設置不同pH值及添加不同濃度的蔗糖和葡萄糖至百蕊草愈傷誘導培養基中，結果表明，最有利于百蕊草愈傷組織誘導和生長發育的pH值約在5.8～6.0之間，且添加30 g·L-1的蔗糖作為外源添加物，對百蕊草愈傷組織的增長具有明顯促進作用[13]。研究者比較了加入不同外源添加物的影響，結果表明在植株擴繁階段添加10 mg·L-1的椰子汁作為外源添加物，能夠給百蕊草生長階段提供營養；其次在組培過程中添加適量的活性炭對百蕊草的生長也是有益的[17]。

表1 百蕊草組培外植體和最適培養基匯總Table 1 A summary on the tissue culture explants and optimal media for Thesium chinense Turcz.

5 百蕊草的栽培利用

5.1 百蕊草人工栽培現狀

百蕊草是我國重要的中草藥資源。由于其分布較廣、植株較小、產量較低，近年來的大量采挖導致百蕊草野生資源日益稀缺[36]，為保護百蕊草資源不再減少并滿足人們日益增長的需求，亟待研究百蕊草的人工栽培技術，優化百蕊草的人工栽培體系。然而，由于百蕊草屬半寄生植物且具有生長周期短、產量低等特點，國內至今未出現大范圍種植百蕊草成功的案例。

在人工栽培百蕊草過程中，不僅要關注產量的問題，其質量的把控也十分重要，薄層色譜法測定百蕊草中山奈酚的含量是百蕊草質量控制的方法之一[37]。藥用植物百蕊草抗菌、消炎等作用是其多種成分聯合作用的結果[8]。王堯等[38]研究表明百蕊草中的紫云英苷發揮抗炎、抗氧化的作用，且能夠抑制破骨細胞的骨吸收。鄭玲玲等[39]在對百蕊草中黃酮類化合物的測定中表明：人工栽培百蕊草的百蕊草素Ⅰ、紫云英苷等含量均顯著高于野生百蕊草。而張成才等[40]通過對人工栽培與野生百蕊草中主要成分的含量對比研究分析發現，百蕊草素Ⅰ和紫云英苷在人工栽培百蕊草中的含量與其野生品種差異顯著，暫不符合藥用要求。不同的植物生長調節劑，也會對植物的生長發育產生影響[41]。人工栽培與野生材料在成分方面存在差異，可能是由于在栽培過程中的養分管理、水分管理等栽培條件產生了偏差。而這也是導致目前人工栽培百蕊草未產生規模化的重要原因。因此，研發百蕊草人工栽培技術時，擴大其產量并且保障質量的研究還需進一步加強。

5.2 百蕊草栽培利用研究進展

限制人工栽培種植的因素主要有：氣候、土壤類型、種子萌發和植株根部養分積累量等。在人工栽培時，需要考慮土壤理化性質、水分需求等栽培技巧[42]。張瑋瑋等[43]通過采集野生百蕊草植株，充分利用地理信息系統數據庫中土壤數據、氣候因子和基礎地理信息等三大數據庫進行分析后發現：中國的東北、華東、華北等地區是適宜百蕊草生活的最佳生態區，主要位于溫帶、亞熱帶季風氣候區；適宜的土地類型主要為褐土、紅壤土、棕壤土等；適宜的自然生長區主要是光照較強地帶、氣候溫暖濕潤地帶、靠近水源和水量充足地帶。因此，在人工栽培百蕊草時需選取光照強、氣候溫暖濕潤的地區，且在栽培過程中需注意及時澆水，保證根部濕潤。Tang等[44]利用Max Ent模型預測了其適宜棲息地，確定了其適宜區域的潛在遷移趨勢，并發現溫度是影響人工栽培百蕊草的最主要因素。宋玲珊等[45]通過野外采樣發現，光照和水分能夠直接影響到百蕊草地上部分分枝數量，從而影響其品質。

張成才等[24]對百蕊草的栽培條件進行了研究。通過設置3個不同溫度、濕度、基質配比和光照時間進行單因素對照實驗，觀察百蕊草植株成活數，計算成活率。研究結果表明：將溫度和濕度分別控制在24℃和75%，蛭石、河沙、營養土、椰糠按照1∶1∶1∶1的比例配置土壤基質，是最適宜百蕊草人工栽培的條件。

百蕊草是半寄生植物，對生長環境具有很高的要求。研究者為探究百蕊草人工栽培模式，對百蕊草物候期及越冬休眠時間進行了研究。通過標記50株百蕊草，每隔15 d觀察1次物候期，結合硫酸蒽酮法和DNS法測定不同生長期時百蕊草的可溶性糖和淀粉含量以及淀粉酶活力，發現百蕊草根內淀粉和可溶性糖可以相互轉化，使得百蕊草在休眠過程中的抗逆能力增強，從而得以順利越冬。1年生百蕊草植株生長期具有豐富的淀粉儲藏在主根，因此在人工栽培百蕊草時，需要考慮提高1年生植株根部營養積累量。宋玲珊等[46]根據研究也得出相同結論。

6 研究展望及建議

目前，國內對百蕊草組培、栽培體系的建立至今未獲得成功，遠不能滿足市場對于百蕊草的需求，應繼續擴大對百蕊草組培和栽培方面的研究，使百蕊草藥材資源得以充分利用。通過對已有文獻及研究的整合，提出以下建議：

(1)利用現有研究結果中破除百蕊草種子休眠期的方法，對種子進行預處理，提升種子萌發率；

(2)選取新鮮的莖、葉作為外植體，在適宜的培養基中進行愈傷組織培養、叢生芽培養和生根培養，為人工栽培百蕊草奠定基礎;

(3)利用人工栽培體系種植方法，選取最適宜百蕊草寄生的植物、土壤等，建立人工栽培百蕊草體系，為百蕊草資源的擴大提供科學依據。