乙醚-乙醇聯合4%中性緩沖甲醛固定法對細胞蠟塊免疫組化染色的效果

王偉力

胸腹腔積液是臨床常見的病癥，發病機制較為復雜，由炎癥、腫瘤等多種因素導致[1]。胸腹腔積液檢查對判定良、惡性疾病的診斷及治療具有重要的意義[2-3]。脫落細胞學檢查是病理診斷常規方法之一，常規的細胞學涂片存在細胞數量少、細胞結構損壞和細胞涂片厚薄不均等缺陷，導致抗原丟失，細胞學診斷的陽性率較低，易發生漏診[4-6]；并且，細胞涂片上腫瘤細胞數量有限，診斷醫師較難判斷腫瘤細胞的來源，也無法進行免疫組化或基因檢測等后續檢測[7]。有研究報道將這些脫落細胞學檢查標本制作成細胞蠟塊，可明顯提高細胞病理診斷的準確性[8]。固定液的選擇對整個細胞蠟塊最后的陽性檢測率、免疫組化的定量和定性有著重要的作用。因此，本研究采用三種固定液對79例肺腺癌胸水脫落細胞蠟塊進行對比染色，觀察其效果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年8月至2022年8月湖州師范學院附屬第一醫院均診斷為肺腺癌的胸水樣本79例，分別采用4%中性甲醛固定（實驗組1），95%乙醇固定（實驗組2），乙醚-乙醇聯合4%中性緩沖甲醛固定（實驗組3）制作細胞蠟塊，以免疫組化Envision法染色。本研究經醫院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 細胞蠟塊固定方法及固定后處理 3組實驗均接受細胞沉渣包埋制塊，沉渣包埋方法為：采集胸水200 ml，先靜置沉淀，倒去上清液，用膠頭滴管吸取3管沉淀物質20 ml，實驗組3加入乙醚-乙醇40 ml，作為前固定，靜置10 min后搖勻離心，離心速度控制為2 000 r/min，時間為10 min，去除上清液，加入40 ml的4%中性緩沖甲醛于沉淀中進行后固定，時間為24 h。實驗組1和實驗組2均搖勻離心，離心速度控制為2 000 r/min，時間10 min，分別加入40 ml 4%中性甲醛和95%乙醇于沉淀中，固定24 h。均用濾紙包裹沉淀，常規脫水，并經石蠟包埋、切片。

1.2.2 免疫組織化學染色 采用Envision兩步法，將切片于65℃烤箱過夜，先后經二甲苯、梯度乙醇脫蠟。使用Tris/EDTApH9.0直接煮沸法抗原修復：將pH9.0 Tris/EDTA濃縮液用蒸餾水按1∶50稀釋，配置適量修復液于不銹鋼鍋中，置于電磁爐上，大功率加熱至沸騰。將電磁爐功率調到最小（保溫狀態），小火煮沸計時20 min，終止加熱，室溫放置10 min，自來水沖冷取出切片，將切片浸泡于3%過氧化氫水溶液，室溫孵育10 min后，于PBS浸泡1～2 min/缸（6缸）。于切片上滴加適量吐溫，室溫孵育10～15 min。除去血清（不清洗），切片上分別滴加一抗MC、CK7、Ki-67，室溫孵育1 h，于PBS浸泡1～2 min/缸（6缸）。除去PBS，切片上滴加二抗，室溫下孵育15～25 min；PBS浸泡1～2 min/缸（6缸）。除去PBS，滴加二抗孵育15 min，二氨基聯苯胺顯色，Harris蘇木素復染，酒精脫水，二甲苯透明，全自動封片機封片。

1.3 免疫組化結果判定 Ki-67表達定位于細胞核內，CK7表達定位于細胞質，MC表達定位于細胞膜，陽性染色均為棕黃色。根據染色強度和表達的完整性評判IHC染色質量：陽性表達強且標志物位置準確，非特異性染色淡或無，核質分明，邊界清楚，判定為優良；未達到上述任何一項則判定為不合格。

1.4 統計方法 采用SPSS 26.0統計軟件進行分析，計量資料以百分率表示，采用2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

采用3種固定液固定的胸水蠟塊在相同腫瘤中均呈陽性，僅用單純的95%乙醇、4%中性甲醛固定液固定的細胞蠟塊免疫標記染色效果欠佳，標記稍減弱。采用乙醚-乙醇作前固定、4%中性緩沖甲醛作為后固定的細胞蠟塊免疫標記染色效果最好，標記清晰，表達率高，MC、CK7、Ki-67在3組中的表達情況差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。Ki-67在實驗組3中呈彌漫、深黃到棕褐色核陽性，見圖1a，在其他實驗組中呈散在分布的核陽性，核呈淺黃到深黃色，部分抗原甚至表達缺失，見圖1b、c。CK7和MC表達定位于細胞膜，在實驗組3中呈棕褐色漿陽性，見圖2a、3a，但在其他實驗組部分細胞中呈淺黃色或陰性表達，見圖2b、2c、3b、3c。

圖1 Ki-67表達情況（Envision法，×100）

圖2 CK7表達情況（Envision法，×100）

表1 3種抗原標記物在各組中的表達情況（n=79）例（%）

3 討論

傳統細胞學涂片缺陷為細胞離心量少[9]，樣本需反復多次離心，耗時長，且大量涂片細胞存在厚薄不均的現象，導致細胞結構不清晰、細胞重疊及細胞成團等情況，嚴重影響病理診斷[10]。細胞蠟塊技術的應用較大程度改善了細胞的組織學形態，更好的保存了細胞結構，減少抗原丟失[11]。細胞蠟塊利用胸腹水標本制作切片進行免疫組化及基因檢測等病理學檢查，對于腫瘤晚期無法手術切除的患者進行基因靶向治療具有較好的參考價值。

固定細胞蠟塊是為了固定組織細胞的形態結構，防止其變形或破裂，保存細胞的抗原，提高檢測效率[12]。細胞蠟塊的固定也是免疫組織化學染色最初的一個關鍵步驟，可以提高抗原檢測的陽性率，彌補組織學上取材的不足，對診斷醫生判斷細胞的來源、分型及評估患者預后有很大的幫助。細胞蠟塊的固定要求細胞核保存好，細胞結構清晰，核質分明，顏色鮮明[13-14]。

圖3 MC表達情況（Envision法，×100）

本研究結果顯示4%中性甲醛為病理組織良好的固定液，但缺乏脫水能力，導致沉淀物不易凝集，細胞浸于體液中造成細胞腫脹，結構模糊，胞核不清。95%乙醇固定液穿透能力強，凝集較快，但細胞嚴重收縮，胞漿呈泡沫狀，胞核不清，免疫組化標記欠佳。通過乙醚-乙醇的前脫水固定及4%中性緩沖甲醛后固定，細胞結構清晰，核漿分明，免疫組化定位準確，抗原量表達較為完整。前固定中乙醇具有脫水和凝集作用，使細胞核收縮明顯；乙醚溶解脂肪從而利于細胞的著色，兩者混合同時具有固定和脫水作用。固定液中還含有冰醋酸的成分，如體液中含有大量紅細胞，還可對其進行破壞和裂解，防止其造成污染。

綜上所述，通過比較3種固定液對細胞蠟塊免疫組化染色質量的影響，筆者認為在胸水細胞學的固定過程中，采用乙醚-乙醇作為前固定聯合4%中性緩沖甲醛作為后固定的細胞蠟塊，可有效保存細胞的良好形態，有效減少抗原丟失，免疫組化染色結果好，為正確高效的病理診斷提供了重要的技術支持。

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