使用致敏因子OVA構(gòu)建大鼠分泌性中耳炎模型

劉懿萱，張南鳳，魯小玲，于慧前

分泌性中耳炎，又稱漿液性中耳炎，以中耳積液和聽力下降為主要特征，是耳科的常見病[1-2]。分泌性中耳炎的病因與發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為分泌性中耳炎的發(fā)病與細(xì)菌和病毒感染、咽鼓管功能障礙、腺樣體肥大或炎癥、過敏性炎癥和咽部返流等相關(guān)[3]。分泌性中耳炎病因和發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性也反應(yīng)了其治療的多樣性，因此需要更進(jìn)一步的研究，而一個有效的動物模型的建立尤其重要。既往研究發(fā)現(xiàn)中耳炎患者的中耳積液中炎癥介質(zhì)富集，包括組胺、腫瘤壞死因子和白介素等，并且炎癥介質(zhì)在動物模型中被證實(shí)可誘導(dǎo)分泌性中耳炎的發(fā)生[4-6]。本研究探討致敏因子雞卵白蛋白（OVA）對大鼠中耳的作用，以及其作為大鼠分泌性中耳炎動物模型誘導(dǎo)因子的有效性，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取40只健康的SPF級Sprague-Dawley（SD）6～8周的雄性大鼠，體質(zhì)量為250～300 g。所有動物購自維通利華（北京），并在復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動物實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行飼養(yǎng)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，所有大鼠均排除耳科相關(guān)疾病。

1.2 造模方法 將大鼠隨機(jī)分為對照組和中耳炎組（OME組）。第一階段為全身致敏階段，在適應(yīng)性喂養(yǎng)后第1天，對照組和OME組的大鼠均通過腹腔注射1.2 mg OVA（A5503，Sigma）（將其溶解在0.6 ml的PBS中，用5.14 mg氫氧化鋁作為免疫佐劑）。第8天，重復(fù)致敏注射。第15和16天是耳內(nèi)激發(fā)階段，在第15天，用10%水合氯醛溶液（330 mg/kg）麻醉大鼠，使用顯微鏡下的微型注射器通過鼓膜的后下象限或前下象限將0.1 mg OVA（將其溶解在35l PBS液中）注射到OME組大鼠雙側(cè)中耳腔中，對照組大鼠則注射等量PBS。第16天，再次麻醉大鼠，重復(fù)鼓膜注射，見圖1。

圖1 大鼠中耳炎模型建造方案

1.3 檢測方法 第16天完成鼓膜注射后即造模完成，進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛溶液行全身麻醉后，進(jìn)行下列觀察及檢測。

1.3.1 鏡下觀察鼓膜 耳內(nèi)鏡下觀察大鼠鼓膜的色澤、形狀以及有無積液等。隨后，斷頭處死大鼠，在解剖顯微鏡下解剖出聽泡，觀察中耳腔積液情況。

1.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色切片觀察 取出的聽泡經(jīng)打孔后，放置于10%的多聚甲醛中，于4℃固定24 h，然后經(jīng)過10%乙二胺四乙酸溶液（EDTA），于4℃脫鈣24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色。通過30×、60×放大倍率的光學(xué)顯微鏡下觀察中耳黏膜，評估中耳損傷的嚴(yán)重程度。

2 結(jié)果

所有大鼠在試驗(yàn)期間行為、飲食及活動均正常，未見意外死亡。

2.1 鼓膜形態(tài) 對照組20只大鼠共40耳，鼓膜呈半透明薄膜狀，橫徑較縱徑長，可分為緊張部和松弛部。緊張部鼓膜透明，可見錘骨柄；松弛部鼓膜向外膨隆，可隨呼吸向鼓室內(nèi)外擺動。均未出現(xiàn)內(nèi)陷、氣液平面或者鼓室內(nèi)氣泡等分泌性中耳炎表型。模型組20只大鼠共32耳，鼓膜出現(xiàn)大量的中耳內(nèi)積液，耳道顯示出清晰的徑向血管分布，可診斷大鼠存在分泌性中耳炎。

2.2 黏膜組織學(xué)改變 對照組20只大鼠共40只耳，中耳黏膜主要是單層扁平上皮，未顯示出異常；而模型組20只大鼠共32只耳，可在鏡下觀察到黏膜和黏膜下組織增厚，見圖2。

圖2 大鼠中耳黏膜組織

3 討論

目前，常用于分泌性中耳炎造模的動物包括大鼠、小鼠、豚鼠和兔等，傳統(tǒng)的建模方法主要有改變咽鼓管結(jié)構(gòu)和功能[7]，包括用木塞、膨脹海綿、燒灼咽鼓管咽口、組織膠等進(jìn)行咽鼓管的機(jī)械堵塞；使用三叉神經(jīng)紊亂、切斷或麻痹腭帆張肌等造成咽鼓管功能障礙；使用細(xì)菌及其產(chǎn)物進(jìn)行鼓室注射造模等[8-10]。近期也有學(xué)者使用基因工程技術(shù)構(gòu)建分泌性中耳炎的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，包括Sh3pxd2b突變小鼠、22q11.2突變雜合突變小鼠、Oxgr1敲除小鼠等[11-12]。對于實(shí)驗(yàn)動物和造模方法的選擇，實(shí)驗(yàn)室往往會根據(jù)實(shí)驗(yàn)工作條件，造模方法的難易程度、可行性及穩(wěn)定性等方面進(jìn)行考慮，會結(jié)合自身研究的切入點(diǎn)選擇或改良合適的建模方法。

本研究考慮到大鼠性格溫和、外耳道較小鼠寬大，且飼養(yǎng)方便的特點(diǎn)，選擇使用大鼠進(jìn)行造模。OVA作為一種致敏因子，不會破壞中耳腔及咽鼓管的正常解剖結(jié)構(gòu)，且不是細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物，不會對分泌性中耳炎的炎癥反應(yīng)及進(jìn)一步的炎癥轉(zhuǎn)歸的觀察產(chǎn)生影響，具有一定的模型優(yōu)越性。本研究采用微型注射器進(jìn)行鼓膜穿刺給藥，可大大減小對鼓膜局部的創(chuàng)傷，極大降低繼發(fā)性感染的可能性。通過耳內(nèi)鏡下觀察鼓膜形態(tài)和鼓室內(nèi)積液情況，可直接為大鼠分泌性中耳炎的診斷提供依據(jù)。HE染色結(jié)果顯示分泌性中耳炎大鼠的鼓室黏膜增厚，并且有炎性細(xì)胞浸潤，這進(jìn)一步說明大鼠分泌性中耳炎模型的成功建立，也從另一方面反映了炎癥細(xì)胞在分泌性中耳炎發(fā)病機(jī)制中的作用，這也是未來研究的方向。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 魯小玲、劉懿萱：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫；劉懿萱、張南鳳：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；魯小玲、于慧前：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持