牛源化膿隱秘桿菌的分離鑒定與黔中金蕎麥體外抑菌試驗

陶小艷，張 濤，史開志，周思旋，唐遠江，趙 宇，黃 波，盧昱希，李 婷，代國滔，任榮清

(貴州省農業科學院畜牧獸醫研究所，貴州 貴陽 550005)

近年來，隨著貴州省肉牛產業的快速發展，牛呼吸道和消化道細菌性疾病常有發生，給養牛業造成巨大的經濟損失?；撾[秘桿菌(Trueperellapyogenes)是導致牛呼吸道綜合征的主要細菌性病原體之一，可引起動物化膿性感染，常表現為肺炎、子宮炎、乳房炎等，嚴重時可直接導致動物死亡[1,2]。貴州省由于氣候比較潮濕，由化膿隱秘桿菌引起的疾病，如子宮內膜炎的發病率常年較高。該菌的致病性主要與它產生的幾種毒力因子相關，plo基因為化膿隱秘桿菌特異性基因及主要毒力因子之一，在所有化膿隱秘桿菌菌株中均有表達[3]。由于疫苗的保護效果不佳，化膿隱秘桿菌感染的預防和治療主要依靠泰樂菌素和四環素類藥物，但濫用抗菌藥會造成嚴重的細菌耐藥性、藥物殘留和食品安全等問題[4]。

中草藥具有低殘留、強免疫、無耐藥、無污染等優點，同時可提高畜禽產品質量，降低飼養成本，在禁抗減抗替抗背景下，為養殖業提供了一種選擇。黔中金蕎麥(FagopyrumdibotrysQian Zhong)是貴州省農業科學院畜牧獸醫研究所自主選育的優質牧草，具有適應性較強、耐刈割利用、易繁殖、高蛋白、低纖維、營養物質豐富等優點，是豬、雞等畜禽喜食的優質青飼牧草[5,6]，且在前期研究中發現，黔中金蕎麥對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌等病原菌具有一定抑制作用，是具有開發價值的藥飼兼用的植物資源。本試驗結合形態學觀察、生理生化和分子生物學鑒定對貴州省凱里市某肉牛養殖場病死牛肺臟分離得到的菌株進行分離、鑒定，并進行藥敏試驗和致病性試驗，通過不同方法對黔中金蕎麥的不同部位進行提取，研究提取物對分離菌株的體外抑菌效果，以期為該肉牛養殖場疫病防控提供參考依據，為黔中金蕎麥應用于?；撾[秘桿菌病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料 病牛肺臟，采自貴州省凱里市某肉牛養殖場病死牛。病死牛表現流涕、咳嗽、喘氣和呼吸困難。剖檢病死牛主要病變為肺臟腫大、出血、黃白色膿汁，肝臟腫大。

1.1.2 植物材料 黔中金蕎麥，于2021年7月采自貴州省農業科學院畜牧獸醫研究所黔西科研實驗基地。

1.1.3 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白胨大豆液體(TSB)培養基，均購自青島海博生物技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；細菌生化管微量鑒定管和藥敏試紙，均購自杭州微生物試劑有限公司；革蘭染色液，購自貴州賽蘭博科技有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)，購自北京百奧萊博科技有限公司；新生牛血清，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；PCR試劑盒，購自擎科生物技術有限公司。

1.1.4 主要儀器 快速梯度PCR儀(型號:Veriti96)，美國Applied Biosystems公司；凝膠成像系統(型號：Gel Doc XR+)，美國Bio-Rad公司；光學顯微鏡(型號：CX31)，日本Olympus公司；恒溫培養箱(型號：GSP-9160MBE)，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

1.1.5 實驗動物 20只健康昆明小鼠，體重(20±2)g，雌雄各半，購自長沙市天勤生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(湘)2019—0014。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離純化和形態學觀察 用75%酒精棉球對采集的肺臟進行表面消毒，無菌取病變組織接種于含有5%血清和10%NAD的TSA培養基上，37 ℃恒溫厭氧培養48 h，觀察菌落形態、透明度、顏色等，挑取平板上的單個疑似致病菌菌落，進行革蘭染色鏡檢，并轉入新的平板進行純化，保存純化菌株備用。

1.2.2 分離菌株的生理生化鑒定 挑取單個菌落接種于細菌生化管微量鑒定管，根據說明書觀察生化管顏色變化，做出對應判斷。根據《常見細菌系統鑒定手冊》[7]中細菌的鑒定特征，對其進行生理生化鑒定。

1.2.3 分離菌株的分子生物學鑒定 按照細菌基因組提取試劑盒說明書對分離菌株的DNA進行提取，采用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTAC-GACTT-3′)，參照參考文獻[8]進行16S rRNA基因序列的擴增，序列大小為1 450 bp，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察記錄結果，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測序結果與已知的9株化膿隱秘桿菌、1株伯納德隱秘桿菌(Arcanobacteriumbernardiae)和1株溶血隱秘桿菌(Arcanobacteriumhaemolyticum)的16S rRNA基因序列進行比對，利用NCBI對分離菌株的16S rRNA基因序列進行BLAST對比分析；運用MAGA 7軟件采用鄰位歸并法(Neighbor joining method)對分離菌株的16S rRNA基因序列構建系統發育樹。

以化膿隱秘桿菌特異性基因plo為目標基因，參考GenBank中已發表的該菌的plo基因設計引物(擎科生物科技有限公司合成)，引物序列為Primer F：5′-GGGAAACAGCTCGGGATTGA-3′，Primer R：5′-AGAAGGCCGTTCAGTCCTTG-3′，序列大小為483 bp。PCR擴增體系(20 μL)：Mix 17 μL，Primer F和Primer R各1 μL，模板DNA 1 μL。PCR擴增條件：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸7 s，循環35次；72 ℃延伸1 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察記錄結果。

1.2.4 分離菌株的藥物敏感性試驗 參照美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)藥敏試驗指南(M02-A11)[9]，采用紙片瓊脂擴散法(K-B)進行藥敏試驗，檢測分離菌株對環丙沙星等16種常用抗菌藥的敏感性，根據耐藥的最小抑菌圈直徑判定分離菌株的藥敏性。

1.2.5 分離菌株的致病性試驗 將20只健康的昆明小鼠隨機分成2個組(雌雄各半)，試驗組腹腔注射濃度為2×109CFU/mL的菌液，0.5 mL/只；對照組注射等劑量的TSB培養基。接種后定期觀察小鼠臨床表現，記錄小鼠發病情況。剖檢死亡小鼠，對從病變組織中分離的細菌進行鑒定。

1.2.6 黔中金蕎麥的處理 將采集的黔中金蕎麥植株清洗干凈，分為地上部分和地下部分。試驗1～10組分別稱取適量植株地上或地下部分干粉(干燥至恒重)，加40倍對應處理溶液，采用超聲、回流、煎煮等不同處理方法進行提??；試驗11～12組將金蕎麥新鮮植株地上部分和地下部分榨成汁液，過濾取汁液。各組處理方式見表1。按不同處理方法得到金蕎麥提取液，烘干至恒重，用無菌水溶解，使各組最終生藥濃度均為0.5 g/mL，0.22 μm細菌濾膜過濾，濾液備用。

表1 各組黔中金蕎麥不同處理方式

1.2.7 分離菌株的體外抑制試驗 分別吸取分離菌株稀釋后菌液(濃度為107～108CFU/mL)100 μL，用無菌涂布棒均勻涂布于TSA培養基上，用直徑為5 mm的打孔器在培養基上打孔，設無菌水為空白對照組，取1.2.6各試驗組藥液100 μL加入對應孔內，4 ℃預擴散1 h，每組重復4次。預擴散結束后，放置于37 ℃恒溫培養18 h，觀察并記錄抑菌結果。

1.2.8 數據統計與分析 運用SPSS 24.0軟件進行數據統計，采用LSD(Least-significant-difference)多重比較法對黔中金蕎麥的體外抑菌試驗數據進行顯著性分析，試驗數據以“平均值±標準誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 分離菌株的形態學觀察 將分離菌接種于TSA培養基上37 ℃厭氧培養48 h后，平板上菌落光滑、致密，呈灰白色，有透明膠狀分泌物，中央凸起(圖1A)。涂片革蘭染色鏡檢，可見分離菌株為革蘭陽性菌，為呈鏈狀排列的短棒狀桿菌(圖1B)。

圖1 分離菌株菌落形態(A)和革蘭染色鏡檢 (B，1 000×)

2.2 分離菌株的生理生化鑒定 分離菌株可發酵葡萄糖、乳糖、果糖、麥芽糖和山梨醇，不發酵蔗糖、半乳糖、甘露醇、尿素和硫化氫等物質。結合《常見細菌系統鑒定手冊》[7]，該分離菌株生理生化特性與化膿隱秘桿菌相符，初步判定為化膿隱秘桿菌。

2.3 分離菌株的分子生物學鑒定 利用細菌通用引物(27F和1492R)對分離菌株的16S rRNA 基因進行PCR擴增，得到特異性的條帶，約為1 450 bp(圖2A)，與目的片段大小相符；基于隱秘桿菌特異性plo基因的PCR擴增出1條特異性條帶，約為483 bp(圖2B)，與預期片段大小相符。系統進化樹分析結果顯示，分離菌株與化膿隱秘桿菌的模式菌株NCTC 5224在同一分支，與溶血隱秘桿菌的親緣關系最遠，與伯納德隱秘桿菌親緣關系次之(圖3)。結合對該分離菌株的細菌常規鑒定，確定為化膿隱秘桿菌，命名為KL-1。

圖2 分離菌株16S rRNA(A)和plo基因(B)的PCR擴增

圖3 基于16S rRNA基因序列構建的遺傳進化樹

2.4 分離菌株的藥物敏感性試驗 如表2所示，該分離菌株對克林霉素、多黏菌素B和慶大霉素完全耐藥；對恩諾沙星、頭孢拉定、左氧氟沙星、諾氟沙星和桿菌肽耐藥；僅對環丙沙星中介；對頭孢他啶、氟苯尼考、利福平、青霉素、頭孢唑林、阿莫西林和頭孢喹肟敏感。

表2 分離菌株藥敏試驗

2.5 分離菌株的致病性試驗 試驗組接種菌液后，小鼠表現精神萎靡、反應遲鈍、動作緩慢等癥狀，在24 h 內全部相繼死亡，而對照組小鼠無死亡。對死亡小鼠進行剖檢，從病變組織中分離的細菌經鑒定分析與接種菌相同。表明該分離菌株可以引起小鼠感染造成死亡，存在致病性。

2.6 分離菌株的體外抑制試驗 如圖4和表3所示，黔中金蕎麥不同組織部位、不同處理方法對化膿隱秘桿菌KL-1均具有一定抑制效果，其中試驗2組對KL-1的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為(28.13±0.25)mm，其次為試驗6組，抑菌圈直徑為(27.43±0.32)mm。從黔中金蕎麥不同組織部位分析，除試驗3組黔中金蕎麥地上部分提取物抑菌效果[(20.83±0.12) mm]好于地下部分[(19.63±0.38) mm]外，其余試驗組均為地下部分提取物抑菌效果優于地上部分。黔中金蕎麥鮮樣處理提取物對化膿隱秘桿菌抑制效果較弱，地上部分和地下部分抑菌圈直徑分別為(13.53±0.21)mm和(15.37±0.15)mm。

圖4 分離菌株抑菌試驗

如表3所示，地上部分和地下部分的總抑菌圈直徑分別為(20.36±3.58) mm和(22.99±1.60)mm，地下部分的總體抑菌效果優于地上部分，但差異無統計學意義(P>0.05)。不同處理方法的抑菌效果存在差異，且具有統計學意義(P<0.05)，其中以70%乙醇回流30 min的處理抑菌效果最好，其次是70%乙醇超聲30 min和水煮沸30 min。

表3 各組黔中金蕎麥提取物的抑菌圈直徑

3 討論

化膿隱秘桿菌是一種與動物黏膜共生的條件性致病菌，為隱秘桿菌屬成員中致病力最高的病原菌；化膿隱秘桿菌通常是動物體內的正常菌群組成之一，常寄生于上呼吸道和消化道黏膜，當機體免疫力下降時其便大量增殖，主要引起豬、牛、羊等經濟型動物多器官和黏膜發生化膿性感染，嚴重感染可引起多重器官衰竭，最后形成膿毒敗血癥而導致動物死亡[10,11]。化膿隱秘桿菌常與其他病原體形成混合感染，在實驗室診斷中常被忽視或誤診。采用PCR技術可快速擴增化膿隱秘桿菌的特異性plo基因，該方法準確、快速，克服了傳統方法生化試驗耗時長等缺點。本試驗從臨床病牛肺組織中分離到1株細菌，根據分離菌的形態特征、生化特性，結合16S rRNA基因序列分析和化膿隱秘桿菌特異性plo基因的PCR擴增結果，鑒定該分離菌株為化膿隱秘桿菌，且其具有一定的致病性，本次試驗首次從貴州地區分離到致病性牛源化膿隱秘桿菌，為該地區該種病原菌引起疾病的防控和治療提供參考依據。

化膿隱秘桿菌不僅對經濟型家畜和野生動物存在危害，還威脅人類的健康，且目前尚無防治該細菌感染的有效疫苗，防治主要依靠傳統的抗菌藥。但抗菌藥濫用導致一些病原菌產生了耐藥性，甚至出現多重耐藥性，使抗菌藥治療效果減弱，治療和養殖成本增多[4,12]。本試驗藥敏試驗結果顯示，分離菌株KL-1對阿莫西林、頭孢喹肟、氟苯尼考、青霉素等藥物高度敏感，因此可用以上藥物對感染動物進行治療。同時，對化膿隱秘桿菌感染的治療藥物研究也在不斷進行，有報道表明，天然產物木犀草素不僅可以通過破壞化膿隱秘桿菌細胞壁和細胞膜的結構、影響蛋白的表達、抑制DNA的合成和干擾能量代謝發揮殺菌作用；還可以通過抑制耐藥性相關基因的表達，減輕化膿隱秘桿菌對四環素類抗生素和慶大霉素的耐藥性[13-15]。天然產物木犀草素的殺菌作用與對耐藥性菌株的抵抗能力，體現出天然植物開發為藥物應用于臨床的優勢。

中草藥因其低殘留、能調節免疫機能、不易產生耐藥性、綠色無污染等優點而在防治疾病中的作用日益顯現。付喜愛等[16]運用黃芩、杜仲、大黃、連翹等15種中草藥對化膿隱秘桿菌進行體外抑菌試驗，其中黃連作用效果最好，最小抑菌濃度(Minimal inhibit concentration,MIC)達0.25 mg/mL，并且對耐苯唑西林的化膿隱秘桿菌依然有良好的抑菌作用；該研究中使用的藥物大都屬寒涼藥物，具有清熱解毒之功效，對抗菌有一定的作用。黔中金蕎麥同樣屬于寒涼性質的清熱解毒藥物，理論上同樣具有抑菌的效果。黔中金蕎麥作為藥飼兼用的優質牧草，相關研究表明，其中活性物質表兒茶素、原花青素B2、蘆丁和槲皮素等黃酮類化合物總含量較野生金蕎麥(貴州、云南、重慶)高，其次還含有多糖、萜類、氨基酸、微量元素和礦物質等活性成分和營養物質[5,17,18]，是具有潛在開發利用價值的天然藥用植物。在進行黔中金蕎麥對分離菌株的抑菌效果試驗中發現，黔中金蕎麥對分離的致病菌KL-1有一定抑制作用，其地下部位醇性溶液(70%乙醇超聲和回流處理)提取物抑菌效果與阿莫西林、頭孢喹肟、青霉素和氟苯尼考相當。中藥材在治療和預防動物感染上與抗菌藥物比較體現出巨大的價值優勢，具有開發成治療化膿桿菌抗感染藥物的潛力，因此可進一步研究黔中金蕎麥對分離菌株KL-1的體外抑菌機制，不僅對有效防治化膿隱秘桿菌引起的各種疾病具有指導意義，并且可為控制病原菌傳播和預防感染提供理論依據；同時進行黔中金蕎麥對該菌株的抑菌作用強度、作用機制以及抑菌活性物質的深入研究，為黔中金蕎麥藥飼兼用功能的進一步開發和利用提供理論依據。