lncRNA在奶牛臨床常見疾病中的應用

劉佳悅，趙芳瑩，張 琰，張 樂，苑金利，陳吉龍，刁洪秀

[1. 福建農林大學動物科學學院(蜂學學院) 福建省畜禽病原感染與免疫學重點實驗室，福建 福州 350002 ；2.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193]

生物體中的RNA種類繁多，功能復雜，按照是否編碼蛋白質可將其分為編碼RNA(Coding RNA)和非編碼RNA(Non-coding RNA,ncRNA)兩大類。隨著轉錄組學的發展和數據的共享，ncRNA的功能研究進入了嶄新的階段，長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在ncRNA 中占比最高，且功能最復雜，已成為國際生命科學領域的研究前沿。大量研究證實，lncRNA具有高度的組織特異性，在表觀遺傳、轉錄以及轉錄后等多重水平上對細胞網絡進行調控，不僅參與機體的生長發育和生理過程，在多種疾病的發生發展過程中也扮演著重要角色，有望成為疾病治療的靶點[1-3]。

我國一直是乳制品需求大國。根據中國海關數據，2021年中國乳制品凈進口385.2萬噸，同比增加18.1%，增速是2020年的2倍[4]，乳制品總需求快速增長。此外，中國乳制品消費水平位于全球前三，奶牛養殖業在國內具有很大的發展潛力，然而奶牛相關疾病的致病機理尚不明確，對于相關疾病的診斷主要依賴于發病后各項生理指標的檢測，此時往往已經造成了不可挽回的損失。因此，從基因水平上了解疾病的致病機理對于奶牛臨床疾病的防治至關重要。本文圍繞近年來lncRNA在奶牛臨床常見疾病領域的新進展及研究策略進行綜述，并展望了lncRNA在奶牛臨床常見疾病中的研究方向，以期為奶牛相關疾病的防治提供新思路。

1 lncRNA概述

哺乳動物基因組中很大一部分都被轉錄成mRNA，然而只有約1.5%的轉錄本編碼蛋白，其余轉錄本均為ncRNA[5]。lncRNA曾經被認為是DNA轉錄異常產生的“垃圾RNA”，盡管缺乏編碼能力，但lncRNA與mRNA仍有許多共同的特征，包括：(1)具有組蛋白標記的活性啟動子；(2)有5′-帽子和Poly-A尾巴；(3)多外顯子轉錄本的剪接[6]。與mRNA相比，許多lncRNA的表達相對較低，進化上的保守性較差，并且具有高度的細胞類型或組織特異性[7]。近年來，隨著新一代測序技術和生物信息學技術的進步，大量研究表明,lncRNA可通過不同機制調節先天免疫反應、免疫細胞的分化和發育、炎癥性疾病和自身免疫性疾病等許多免疫過程[8]。lnc641可通過抑制JAK-STAT1途徑來促進偽狂犬病毒的復制[9]。linc-satb1可通過上調免疫應答基因和細胞免疫來破壞馬立克氏病毒感染的細胞[10]。檢測不同細胞或疾病狀態下的lncRNA表達量有助于理解其功能、揭示其作用機理，并可作為疾病診斷的潛在標志物和治療新靶點。

2 lncRNA與奶牛臨床常見疾病

2.1 奶牛乳腺炎 奶牛乳腺炎是臨床上奶牛常見疾病之一[11]，常常引起奶牛的產奶量降低，乳營養成分降低。盡管乳腺炎可治愈，但治愈后的奶牛產奶恢復緩慢，飼養成本增加，造成大量的經濟損失。乳腺炎的病理機制至今尚未完全明確[12]，細菌感染、飼養管理不當、遺傳因素等均可引起奶牛乳腺炎，臨床上一般把大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為奶牛乳腺炎的重點防控病原菌[11]。奶牛乳腺炎發病機制復雜，臨床上一般應用廣譜抗生素進行治療，但極易造成細菌耐藥，不利于奶牛業的發展[13]。

奶牛乳腺炎的基本癥狀是患畜局部炎癥，主要表現為乳汁異常，乳房不同程度的充血、增大、發硬、溫熱和疼痛。大量研究表明，lncRNA可在炎癥中發揮重要作用，如lncRNA-NEAT1是炎癥體激活的常見介質，可激活小鼠體內NLRP3、NLRC4和AIM2等炎性小體，增強它們的組裝和隨后的Caspase-1前加工，并進一步通過級聯效應促進小鼠機體炎癥反應[14]；lnc-IL7R可減輕脂多糖(LPS)誘導的炎癥反應，敲除lnc-IL7R會增加IL-6和IL-8等炎性因子的釋放[15]。與人和小鼠相比，奶牛相關的lncRNA研究還處于初始階段，因此在基因水平上揭示奶牛乳腺炎復雜的致病機理的報道應運而生。

H19是人類發現的第一個lncRNA，全長2.3 kb[16]。研究發現，H19在胃癌、乳腺癌、口腔癌和膽管癌等多種腫瘤中都發揮重要作用，涉及PI3K/Akt、Wnt/β-catenin、NF-κB、JAK/STAT等多條經典致癌信號通路[17]。H19除了參與各種癌癥的病理過程，其作為一種正向炎癥調節因子，在NF-κB、p38/MAPK/mTOR、Toll樣受體和TNF-α等典型炎癥通路基因網絡具有重要的調節作用[18]。因此猜測H19在牛乳腺上皮細胞的炎癥反應中也起到一定作用。將H19轉入牛乳腺上皮細胞(MAC-T)中發現，過表達H19通過促進炎癥因子TNF-α、IL-6、CXCL2和CCL-5的表達，激活了NF-κB信號通路，從而影響LPS誘導的MAC-T細胞的免疫應答[19]。除了H19，XIST也是調節奶牛乳腺炎的重要分子。XIST是由雌性哺乳動物中失活的X染色體轉錄而來的一個長度為17 kb的lncRNA，其與H19的作用機理相似，不僅在人類的多種癌癥中發揮重要的調節作用，并且與哺乳動物多種疾病的發生密切相關。馬夢汝[12]研究發現，XIST可與NF-κB/NLRP3信號通路相互作用，抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎性細胞因子的表達。

LncRNA在大動物方面的研究處于碎片化狀態，缺乏系統的研究，相關數據庫中lncRNA的注釋不夠全面，普遍缺乏系統和統一注釋。西北農林科技大學高明清研究團隊通過高通量測序等探究奶牛乳腺炎方面未注釋的lncRNA，使用熱滅活的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌處理MAC-T建立乳腺炎細胞模型，并通過高通量測序分析獲得了正常細胞和乳腺炎模型細胞的lncRNA表達譜，鑒定出53個顯著差異表達的lncRNA，發現了1個新的lncRNA，命名為lncRNA-TUB，并展開了一系列的研究；lncRNA-TUB參與了奶牛乳腺上皮細胞的增殖和遷移，β-酪蛋白分泌，炎性應答以及上皮細胞間質樣轉化等一系列生理病理過程，其可能作為免疫反應中炎癥因子之間的重要元件發揮作用[11]。另一項研究發現，新鑒定的lncRNA，即LRRC75A-AS 1可影響緊密連接蛋白(Claudin-1、Occludin和ZO-1)的表達來調節細胞通透性及細菌侵襲和粘附能力，并通過NF-κB通路激活炎癥應答[13]。與之相似，Mi等[20]通過高通量測序和KEGG通路富集分析發現PRANCR和TNK2-AS1這2個lncRNA廣泛參與金黃色葡萄球菌攻擊誘導的炎癥反應。Tucker等[21]鑒定出NONBTAT027932.1和XR_003029725.1與奶牛乳腺炎免疫反應相關的多個候選基因相關聯。PRANCR、TNK2-AS1、NONBTAT027932.1和XR_003029725.1可作為奶牛乳腺炎的疾病標志物和治療干預位點，有進一步深入研究的價值。

綜上所述，lncRNA可以在基因水平揭示奶牛乳腺炎復雜的致病機制，為奶牛乳腺炎臨床早期預測提供潛在的標志物和治療的有效靶點。

2.2 奶牛熱應激 熱應激會導致奶牛產奶量下降和臨床疾病高發。以往對于奶牛熱應激的研究多集中于微RNA(microRNA,miRNA)，如在熱應激荷斯坦奶牛體內高表達的bta-miR-19a、bta-miR-19b和bta-miR-1246等可以作為診斷奶牛熱應激狀態的標志物[22]。Li等[23]通過RNA-seq技術發現，在熱應激狀態下差異表達的miRNA與Wnt、TGF-β、MAPK、Notch和JAK-STAT等信號通路的調控有關。隨著高通量測序技術的推廣和研究的深入，研究視線開始聚焦于lncRNA。Li等[24]率先通過RNA-seq技術檢測并分析了熱應激和非熱應激奶牛乳腺中lncRNA表達譜，發現lncRNA TCONS_00023306、lncRNA TCONS_00005946和lncRNA TCONS_00102876等可能作為miRNA的初級轉錄本發揮作用，并提出了lncRNA和miRNA之間可能存在的深層次聯系，為進一步研究lncRNA在奶牛中的作用機制提供了新思路。楊影[25]在LPS誘導的乳腺炎模型中應用RNA-seq篩選并鑒定得到34個差異表達的lncRNA，經GO富集分析和KEGG通路分析發現，這些差異表達的lncRNA涉及核苷酸切除修復、NF-κB信號通路、細胞粘附和免疫應答等多個生物學進程；在后續的lncRNA功能研究中發現，干擾lncRNA TCONS_00014079表達后能夠顯著降低TNF-α、IL-6和IL-8的表達，提示lncRNA TCONS_00014079參與了炎癥反應和免疫應答。

綜上所述，lncRNA在奶牛熱應激中發揮重要的調節作用，并參與了免疫反應應答，為熱應激導致的乳房炎的診斷和防治提供了新思路。

2.3 奶牛子宮內膜炎 奶牛子宮內膜炎也是奶牛臨床常見疾病之一，會導致奶牛的屢配不孕、流產、胎間距上升和產奶量下降，致使奶牛的淘汰率上升，造成重大的經濟損失。目前對子宮內膜炎的臨床診斷主要依賴于產后陰道黏液檢查，一旦檢測指標異常便代表奶牛已發病。因此，將目光聚焦于高通量測序，篩選相關生物標志有助于疾病的監測、早期診斷和治療。以往對于奶牛子宮內膜炎的研究大多聚焦在miRNA和差異基因，如Oladejo 等[26]發現miR-24-3p可通過靶向降低LGALS9基因的表達抑制促炎TLR4/NF-κB信號通路，從而調節奶牛的子宮內膜炎。隨后他又發現miR-24-3p也可以通過靶向降低TRAF6基因來抑制NF-κB/MAPK信號通路，減輕奶牛子宮內膜的炎癥[27]。miR-24-3p可能是子宮內膜炎的重要治療靶點。Jiang等[28]通過miRNA芯片分析和相關試驗得出，上調差異表達的miR-92b可通過激活PI3K/AKT/β-catenin途徑抑制促炎TLR4/NF-κB信號通路，這項研究為奶牛子宮內膜炎提供了一種新的干預療法。Jiang等[29]還發現miR-30a可通過抑制MyD88/NOX2/ROS激活的NF-κB途徑發揮治療奶牛子宮內膜炎的作用。

隨著研究的深入，lncRNA在奶牛子宮內膜炎中的作用逐漸突顯出來。李亞娟[30]對發病或未發病的奶牛子宮病料進行高通量測序，揭示了奶牛子宮內膜組織中lncRNA表達譜，共檢測到6 201個差異表達的lncRNA，對其進行功能富集發現，差異表達的lncRNA參與先天性免疫調節、細菌粘附等生物學進程的調節，KEGG分析發現，差異表達的lncRNA參與cAMP信號通路、PPAR信號通路等。而Sheybani等[31]應用加權基因共表達網絡(WGCNA)方法對奶牛子宮內膜炎中的mRNA、lncRNA和miRNA的互作進行網絡整合。這種方法以網絡中高度連接的基因(Hub)為中心，有利于剔除冗余數據，更精確鎖定后續研究目標。如BTA-miR-449a和BTA-miR-449b這2個miRNA靶向Hub-Hub lncRNA ENSBTAG00000049936,已有研究證明miR-449a和miR-449b-3p在炎癥中起一定的調節作用[32,33]。因此，lncRNA ENSBTAG00000049936可能是導致奶牛子宮內膜炎進展的潛在基因，可被視為奶牛子宮內膜炎的生物標志物和治療靶點進行后續研究。

綜上所述，ncRNA在奶牛子宮內膜炎領域的研究以miRNA為主，lncRNA的研究相對較少。針對奶牛乳腺炎相關的lncRNA進行研究既可以填補該領域的研究空缺，又有助于進一步闡明奶牛子宮內膜炎的潛在機制，是有價值的研究路線。

2.4 奶牛副結核 奶牛副結核(Johne's disease,JD)是由禽副結核分枝桿菌亞種(Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis,MAP)引起的反芻動物的一種慢性肉芽腫性腸道感染副結核病，是一種慢性消耗性疾病，會導致病牛體重減輕、腹瀉和產奶量逐漸下降，最終導致死亡。JD是一種多因素感染病，病牛在達到臨床階段之前不會出現任何癥狀，只有在臨床階段才能檢測到這種感染[34]，并且其病原學和潛在的分子機制尚未完全闡明。因此，識別與這種感染相關的關鍵基因和途徑可能是預防臨床感染發病的有效途徑。

Gupta等[35]分析了來自MAP感染和未感染的原代牛巨噬細胞的高通量RNA-Seq數據，結果顯示，在JD感染中差異表達的lncRNA可以調控TNIP3、TNFAIP3和NF-κB2等基因的表達，影響TNF、NF-κB和TLR等與免疫反應相關的信號通路；在JD感染組中隨機選擇3個lncRNA，用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法分析其表達，結果顯示，XLOC_000633表達極顯著上調，XLOC_030080和XLOC_029370表達顯著上調，表明這3個lncRNA可以作為檢測受感染動物的潛在生物標志物，但還有待于進一步研究。以往對JD的研究一般使用體外感染的奶牛巨噬細胞鑒定lncRNA，但外源血清會影響巨噬細胞的極化，導致測序結果不準確，故Marete等[36]應用RNA-seq技術檢測自然狀態下JD陽性奶牛巨噬細胞中的lncRNA，發現了605個差異表達的新lncRNA，其可以調控包括CCDC174、ERI1、FZD1、TWSG1、ZBTB38、ZNF814和ZSCAN4共7個基因的表達，影響奶牛自身的免疫調節和MAP的感染。Heidari等[37]從NCBI的GEO數據庫中下載JD相關數據，使用WGCNA方法構建了完整的調控網絡，可以更全面地了解MAP感染的分子機制，該研究鑒定了hub和hub-hub基因以及未保存的模塊中的TF和lncRNA后，構建了lncRNA-mRNA-TF整合網絡，鑒定出47個新的lncRNA，其中有21個與免疫系統和MAP感染相關；其中被鑒定為hub-hub基因的lncRNA ENSBTAG00000052980、lncRNA ENSBTAG00000049459、lncRNA ENSBTAG00000049459、lncRNA ENSBTAG00000053153和lncRNA ENSBTAG00000050877可能成為診斷MAP感染的生物標志物。

3 展望

近年來隨著新一代測序技術的發展，lncRNA已經成為生命科學領域的研究熱點。哺乳動物的lncRNA除了與機體的炎癥和獲得性免疫有關外，還參與病毒感染后的天然免疫調節。與人和鼠的基因組相比，家畜的lncRNA的基因組注釋仍然非常稀少，隨著研究的不斷深入，會有更多新的lncRNA轉錄本，但lncRNA調控的復雜性以及研究的相對困難性，導致對lncRNA生物學功能的認識和研究不夠深入全面，尤其是在奶牛臨床疾病方面，大多數的研究僅停留在尋找具有特殊作用的lncRNA或作為某種疾病的潛在標志物，尚缺乏系統全面的研究。近年出現了一種基于WGCNA網絡的互作網絡整合方法。盡管WGCNA網絡對mRNA、lncRNA和miRNA的互作整合有助于理解疾病發生中的功能網絡通路，但這種研究方法只考慮了高度關聯的基因(中樞和中樞-中樞)的網絡關鍵部分，缺乏實際試驗的驗證。相信隨著新一代測序技術的不斷發展和相關研究的不斷深入，可以在這2種類型的研究方法中找到一個平衡點，在精準把控疾病的生物學標志基礎上，全面深入理解奶牛臨床常見疾病的病原學和潛在的分子機制，為我國畜牧獸醫事業的發展提供保障。