復方蒲蠊提取物對潰瘍性結腸炎大鼠菌群的干預作用

伍建中，李修琴，莫雙銘，張 艷，巫秀美，劉 衡，李 玥，游海濤

(1. 岳池縣人民醫院藥劑科，四川 岳池 638300 ； 2. 大理大學 云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理 671000 ；3. 河南醫藥健康技師學院，河南 開封 475000 ； 4. 黔西南民族職業技術學院，貴州 興義562400 ； 5. 大理大學公共衛生學院，云南 大理 671000)

潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)是一種炎癥性腸病，其臨床表現主要為腹痛、腹瀉、血便等。UC在全世界的發病率逐年攀升，相對于歐洲而言，中國的UC發病率增長更快[1]。研究顯示，UC的發生與免疫、環境和腸道菌群變化有關[2]。腸道菌群在維持腸道免疫和保護黏膜屏障方面發揮著重要的作用，同時菌群的變化也會干預UC病程發展和影響藥物療效[3]。

中藥具有多成分作用于多靶點的特征，在治療UC這類病因復雜的難治性疾病中有著能夠整體調節的優勢。本課題組前期研究發現，以蜚蠊(PeriplanetaamericanaL.)為主要原料藥的康復新液可以通過促進腸黏膜愈合和改善腸道菌群來緩解UC[4]，但對于病因復雜的UC，單一的藥物并不能滿足臨床治療的需求。目前臨床治療UC的中藥常以復方配伍為主，如結腸寧、益氣湯和白頭翁湯等。因此，本試驗所在研究團隊篩選了具有抗炎作用的蒲公英提取物[5]與蜚蠊提取物(康復新液)配伍，制成復方蒲蠊提取物PL1(1∶2)和PL2(2∶1)，采用2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB)聯合醋酸建立UC大鼠模型，而后以雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、腸球菌、大腸埃希菌和硫酸鹽還原菌作為研究對象，探討復方蒲蠊提取物治療UC的可能機制，分析復方蒲蠊提取物對UC的治療作用，以期為治療UC的蒲蠊藥物研發提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體重180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2013—0004。

1.2 主要儀器 實時熒光定量 PCR 儀(型號：StepOneplus RT-PCR)，美國應用生物系統公司產品；梯度 PCR 儀(型號：MyCycler)，美國伯樂公司產品；凝膠成像分析系統(型號：InGenius)，美國Syngene公司產品；核酸蛋白分析儀(型號：NANODROP2000)，美國賽默飛世爾科技公司產品。

1.3 主要試劑 糞便 DNA 提取試劑盒(批號：DP328)，購自北京天根生化科技有限公司；SYBR Green I 熒光定量 PCR 預混液 UNG(含 ROX)(批號：6BBC01)和DNA 分子量標準(批號：M1061)，均購自北京康潤誠業生物科技有限公司；二甲基甲酰胺(批號：3AF01)，購自北京鼎國昌盛生物技術公司；2，4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB)(批號：P8585)，購自山東西亞化學工業有限公司；冰乙酸(批號：20150604)，購自瑞金市瑞金特化學品有限公司；X-gal(批號：AC18BA0016)，購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.4 試驗藥物 康復新液(批號：150427)，購自四川好醫生攀西藥業有限責任公司；復方蒲蠊提取物 PL1(批號：150305)和復方蒲蠊提取物 PL2(批號：150302)，由大理大學昆蟲生物醫藥研究院張成桂教授提供。

1.5 試驗方法

1.5.1 實驗動物造模及分組處理 60只大鼠適應性喂養1周，選取6只作為正常對照組，雌雄各半，剩余大鼠參照參考文獻[6]方法，采用DNCB聯合醋酸進行UC造模；造模后參照參考文獻[7]標準進行疾病活動指數(Disease activity index，DAI)評分，剔除不合格的大鼠，剩余造模成功的大鼠隨機分成8個組，每組6只，雌雄各半，分別為模型組、陽性對照組[康復新液組3 g/(kg·bw)][8]、PL1低劑量組[0.05 g/(kg·bw)]、PL1中劑量組[0.1 g/(kg·bw)]、PL1高劑量組[0.2 g/(kg·bw)]、PL2低劑量組[0.05 g/(kg·bw)]、PL2中劑量組[0.1 g/(kg·bw)]、PL2高劑量組[0.2 g/(kg·bw)]，各給藥組每日灌腸給予相應藥物，模型組和正常對照組在相同操作下給予等量的生理鹽水，連續給藥14 d，1 次/d，分別于給藥后1、4、7和14 d評價DAI。

1.5.2 結腸組織檢測指標 末次給藥后，禁食不禁水12 h，處死大鼠。將大鼠浸泡于75%乙醇5 min，轉入超凈工作臺，解剖，取出結腸，收集結腸糞便樣品，記錄結腸長度。沿腸系膜剖開結腸，生理鹽水沖洗干凈后觀察結腸組織狀態，參照Ekstr?m[9]制定的評分標準(表1)進行結腸黏膜損傷指數(Colon mucosa damage index，CMDI)評分。隨后用濾紙吸干結腸表面水分，稱重，計算結腸指數[結腸指數(g/kg)=結腸重量÷體重]。

表1 CMDI評分標準

1.5.3 病理組織學評分(Histological score，HS) 將結腸組織制作病理切片，蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining，H.E.)染色，光學顯微鏡下觀察病理變化，參照Obermeier等[10]制定的評分標準(表2)進行HS評分。

表2 HS評分標準

1.5.4 實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)檢測 腸道菌群對維持腸道穩態有著重要的作用，在UC的發病中常常伴隨著益生菌和機會致病菌的失衡，而它們的失衡又會加重UC[11]，腸道菌群的變化一定程度上反映了UC病情的進展。因此，本試驗根據文獻報道選取了UC患者中常見的益生菌和致病菌[12]進行檢測，以分析復方蒲蠊提取物治療UC大鼠的可能機制。糞便樣品按照糞便 DNA 提取試劑盒說明書中的操作方法進行操作，提取糞便細菌基因組DNA。根據參考文獻[13]設計菌種特異性引物(表3)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。反應體系(20 μL)：10 μL SYBR Mixture UNG(含 ROX)預混液、2 μL模板，0.5 μL上游引物(10 μmol/L)和 0.5 μL下游引物(10 μmol/L)，最后用滅菌 ddH2O補足，每個樣本設置3個復孔。反應條件：95 ℃預變性 15 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35 個循環；60～95 ℃進行熔解曲線分析，根據熔解曲線分析反應產物的特異性，并由 StepOne Plus PCR 儀分析結果。

表3 引物信息

2 結果

2.1 復方蒲蠊提取物對UC大鼠DAI評分的影響 結果如圖1所示，試驗期間正常對照組大鼠DAI評分基本無變化；與正常對照組相比，模型組和給藥組大鼠在給藥第1天DAI評分均極顯著升高(P<0.01)，提示造模成功；在給藥第14天，與模型組相比，陽性對照組、PL1各劑量組和PL2各劑量組DAI評分均極顯著降低(P<0.01)。

圖1 復方蒲蠊提取物對UC大鼠DAI評分的影響

2.2 復方蒲蠊提取物對UC大鼠結腸組織的影響 肉眼觀察結腸，正常對照組結腸黏膜無水腫、糜爛和潰瘍形成，模型組大鼠結腸近肛端腸壁可見明顯的充血和水腫，腸壁黏膜可見散在的潰瘍點和糜爛。如圖2所示，與正常對照組相比，模型組結腸長度極顯著變短(P<0.01)、CMDI和結腸指數均極顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組、PL1各劑量組和PL2各劑量組結腸長度明顯增加(P<0.05或P<0.01)，各給藥組CMDI有降低趨勢，但無統計學差異(P>0.05)，陽性對照組、PL1各劑量組和PL2各劑量組結腸指數明顯降低(P<0.05或P<0.01)。

圖2 復方蒲蠊提取物對UC大鼠結腸組織的影響

2.3 復方蒲蠊提取物對UC大鼠結腸組織HS的影響 顯微鏡下觀察組織切片，結果如圖3所示，正常對照組細胞結構完整清晰，可見明顯的隱窩和杯狀細胞，基本無充血、水腫和炎性細胞浸潤，模型組出現結腸上皮細胞、隱窩和杯狀細胞大面積丟失，大量炎性細胞浸潤。與模型組相比，陽性對照組、PL1各劑量組和PL2各劑量組大鼠結腸杯狀細胞和隱窩均出現不同程度的好轉，炎性細胞浸潤也相對減少。如圖4所示，與正常對照組相比，模型組結腸上皮細胞HS評分、炎性細胞HS評分和HS總評分均極顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組、PL1各劑量組和PL2各劑量組大鼠上皮細胞HS評分、炎性細胞HS評分均有一定程度降低，HS總評分明顯降低(P<0.05或P<0.01)。

圖3 UC大鼠病理組織切片(H.E.染色，200×)

圖4 復方蒲蠊提取物對UC大鼠結腸組織HS的影響

2.4 復方蒲蠊提取物對UC大鼠腸道菌群的影響 qPCR結果如圖5所示，與正常對照組相比，其余各組腸道總菌群數無統計學差異(P>0.05)；與正常對照組相比，模型組擬桿菌、大腸埃希菌、腸球菌和硫酸鹽還原菌極顯著增多(P<0.01)，雙歧桿菌和乳桿菌極顯著減少(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組、PL1各劑量組和PL2各劑量組擬桿菌、大腸埃希菌、腸球菌和硫酸鹽還原菌顯著減少(P<0.05或P<0.01)，雙歧桿菌和乳桿菌極顯著增多(P<0.01)。

圖5 細菌實時熒光定量PCR結果

3 討論

UC的發生是由多種致病因素共同作用的結果，單一的造模試劑不能完全反映UC的發病機制。研究顯示，與單一試劑誘導UC相比，2,4-二硝基氯苯(DNCB)聯合醋酸進行UC造模不僅沒有DNCB造模病程短、自愈性強和醋酸造模不具有免疫反應的缺點，而且組織學改變與人類 UC 更為相似，是一種理想的UC模型[14]。因此，本試驗通過DNCB聯合醋酸建立大鼠UC模型，研究復方蒲蠊提取物PL1、PL2對UC的療效及對腸道菌群的影響。結果顯示，造模后大鼠出現腹瀉、血便、體重下降等癥狀，DAI評分升高，提示造模成功。經康復新液、蒲蠊提取物PL1和PL2治療后，UC大鼠DAI、CMDI和HS評分均有不同程度的改善，提示PL1和PL2對UC有一定的緩解作用，推測PL1和PL2對UC的治療作用可能與含有保護腸道黏膜的蜚蠊[15]和抗炎效果的蒲公英[16]等有關。腸道菌群是機體腸道黏膜的重要組成部分，正常情況下可以通過參與各種生理功能來保護腸道黏膜[17]。然而當機體受到環境、飲食和用藥等因素影響時，就會引起腸道微生態失衡，繼而引發異常的免疫反應和代謝功能[2]，造成腸道黏膜損傷。腸道菌群中有益菌和致病菌的失衡與胃腸道炎癥的發生和進展密切相關，乳桿菌和雙歧桿菌可以通過增加短鏈脂肪酸和丁酸鹽水平來抑制免疫炎癥[18]；硫酸鹽還原菌則可產生具有細胞毒性的代謝產物硫化氫而導致腸道屏障物理性和生物性的破壞[19]；擬桿菌和大腸埃希菌與宿主的關系則更為微妙，當宿主免疫功能正常時兩者屬于共生關系，能夠維持宿主的免疫平衡，但當宿主免疫功能失調時兩者會促進腸道炎癥的發生[20]。本試驗實時熒光定量 PCR 結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠腸道菌群明顯失調，雙歧桿菌和乳桿菌數量極顯著減少(P<0.01)，腸球菌、硫酸鹽還原菌、擬桿菌和大腸埃希菌數量極顯著增多(P<0.01)。本試驗結果與現有研究報道的UC患者腸道菌群的變化結果[21]基本一致，這種改變可能與腸道微環境被破壞有關。

中藥具有多途徑、多靶點的優勢，具有調節腸道菌群，抑制炎癥反應和保護腸道黏膜屏障的作用。研究顯示，相比于西藥，中藥治療UC能夠有效緩解 UC癥狀，促進腸道黏膜恢復并減少復發[22]。蜚蠊具有一定的腸道菌群調節[23]和黏膜保護[24]功能，而蒲公英能夠通過作用于IL-6/STAT3來緩解腸道炎癥[25]。本試驗通過現代工藝將蜚蠊和蒲公英制成PL1和PL2提取物，結果顯示，與模型組相比，PL1各劑量和PL2各劑量組致病菌和有益菌的平衡都得到了一定恢復，該腸道菌群變化結果與現有研究報道結果[26]相符，提示PL1和PL2對UC的治療作用可能與對腸道菌群的有益調節有關，兩者對腸道菌群的調節作用相當，且PL1和PL2高劑量組對于腸道菌群的調控作用要優于康復新液，提示中藥復方制劑在一定程度上優于單方制劑。

綜上所述，復方蒲蠊提取物PL1和PL2能夠改善UC大鼠的疾病活動指數，保護大腸腸道黏膜和抑制腸道炎癥，對UC大鼠具有一定的治療效果，其機制可能與調節UC大鼠腸道菌群組成，維持腸道菌群平衡有關。UC的發病機制復雜，單一的藥物治療并不能起到良好的治療效果。中藥具有多成分多靶點的優勢，利用藥性特點制成復方制劑或許是治療UC的一種有效方法。