豬細(xì)小病毒疫苗研究進(jìn)展

施麗薇，承 南，高新樂，胡 芳，董彥鵬

(江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司，江蘇 江陰 214400)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起豬繁殖障礙的重要病原，不同品系和不同日齡的家豬和野豬均可感染。豬細(xì)小病毒病呈季節(jié)性流行，春夏產(chǎn)仔季節(jié)多發(fā)，母豬感染后主要表現(xiàn)為流產(chǎn)，產(chǎn)弱仔、死胎、木乃伊胎，仔豬感染后表現(xiàn)為消瘦、生長受阻、皮炎、非化膿性心肌炎等。PPV屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬，為無囊膜單股DNA病毒，基因組大小為4.0～6.3 kb，編碼的衣殼蛋白包括VP1、VP2和VP3。其中VP2是PPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在聚集和包裝子代單鏈DNA中發(fā)揮重要作用，且其N端肽段可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，對PPV的免疫原性和毒力有較大影響。我國最早于1983年分離到PPV[1]，此后多地出現(xiàn)PPV感染。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和新型檢測技術(shù)的運(yùn)用，研究發(fā)現(xiàn)PPV不斷出現(xiàn)新的毒株，且毒株易發(fā)生變異和重組，存在致病性增強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)[2]。此外，PPV對外界環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。PPV感染力強(qiáng)，且常與豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovius type 2，PCV2)、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)等混合感染豬群，引發(fā)更嚴(yán)重的問題。研究顯示，一些豬群中豬細(xì)小病毒病的檢出率可達(dá)85%，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失[3]。豬群一旦感染PPV則很難清除，目前尚無有效治療方法，因此豬細(xì)小病毒病的防治仍以疫苗接種為主。目前，研發(fā)的PPV疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗。

1 滅活疫苗

滅活疫苗是將病原體經(jīng)理化方法滅活后加入佐劑制成，該方法可使病原體失去感染性，但仍保留其免疫原性。滅活疫苗具有安全性高、保存方便等優(yōu)點(diǎn)，但誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體較慢、需要多次接種，且產(chǎn)生的抗體水平不如活疫苗。

國外自1976年就已出現(xiàn)PPV滅活疫苗的相關(guān)研究報(bào)道[4]，但Jówik等和Foerster等均發(fā)現(xiàn)全病毒PPV滅活疫苗僅可保護(hù)豬群不出現(xiàn)臨床癥狀[5,6]。我國學(xué)者最早于20世紀(jì)80年代開始研制PPV滅活疫苗，之后通過改變佐劑、篩選細(xì)胞適應(yīng)株、研制多聯(lián)疫苗等途徑進(jìn)行了改進(jìn)。潘雪珠等利用1983年分離獲得的PPV S-1株的豬睪丸細(xì)胞適應(yīng)毒作為種毒，經(jīng)N-乙酰乙烯亞胺(N-acetylethylenimine，AEI)滅活制成疫苗，并證明該疫苗安全且免疫持續(xù)期至少為7個(gè)月[7]。鄔捷等將SR-1株經(jīng)甲醛滅活制成氫氧化鋁滅活苗，免疫豬群后獲得較好的免疫效果[8]。徐滌平等首次采用幼齡胎豬增殖PPV，以蜂膠為佐劑，所獲得的疫苗可刺激動(dòng)物產(chǎn)生高滴度抗體，注射1次即可產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)[9]。葉向陽等將S-1株疫苗中的AEI改為白油，改良后的疫苗免疫劑量小、使用方便、免疫效果好[10]。呂建強(qiáng)等于2005年研制的PPV-PRV二聯(lián)油乳劑滅活疫苗，可簡化免疫程序，降低生產(chǎn)成本[11]。此后，研究人員相繼研制出了PPV的單價(jià)或多聯(lián)滅活疫苗。吳云飛根據(jù)PPV增殖規(guī)律篩選出PPV的豬腎(Porcine kidney-15，PK15)細(xì)胞適應(yīng)株，并選擇不同佐劑制備滅活苗，其中白油和鋁膠佐劑制備的疫苗保護(hù)率均可達(dá)100%[12]。郭龍飛研制的PCV2-PPV-豬乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)三聯(lián)滅活疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體可持續(xù)10周以上[13]。孫秀使用GD分離株制備的滅活苗免疫豚鼠和后備母豬，28 d后血凝抑制(Hemagglutination inhibition，HI)抗體均達(dá)26以上[14]。2020年，Zhou等以水溶性N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖為佐劑，制備的PPV滅活苗可提高體液免疫水平[15]。

目前，我國正在使用以及新注冊的PPV疫苗均為滅活疫苗，所用的毒株包括L株、YBF01株、BJ-2株、NJ株、CG-05株和SC1株等(表1)，進(jìn)口的PPV疫苗僅有西班牙海博萊生物大藥廠生產(chǎn)的豬細(xì)小病毒病、豬丹毒二聯(lián)滅活苗，毒株為NADL-2株。

表1 國內(nèi)進(jìn)行新獸藥注冊的PPV疫苗

2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是指應(yīng)用經(jīng)自然篩選或人工致弱獲得毒力減弱但仍具感染力的毒株制備的疫苗。該類疫苗免疫效力強(qiáng)，產(chǎn)生抗體快，但常需低溫保存，且存在毒力返強(qiáng)、病毒重組等風(fēng)險(xiǎn)。

由于自然界中PPV廣泛流行，弱毒疫苗存在與自然毒株重組的風(fēng)險(xiǎn)，且對于豬群有一定的致病性，使用受限，因此國內(nèi)外對于弱毒疫苗的研究較少。NADL-2株是最早應(yīng)用于臨床的弱毒株，該毒株是PPV的細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)株，接種豬群可刺激機(jī)體產(chǎn)生HI抗體，但僅限于未懷孕母豬使用，懷孕母豬子宮內(nèi)接種會對胎兒致病，安全性有待提高。Fujisaki等通過在豬源細(xì)胞上連續(xù)低溫傳代90HS株，獲得弱毒力的HT株，該變異株制備疫苗免疫豬群后攻毒，豬群未出現(xiàn)感染癥狀且組織檢測均為PPV陰性[16]。蔣玉雯等在廣西分離到PPV的自然弱毒N株，制備疫苗免疫小豬、后備母豬和懷孕母豬后均可抵抗PPV強(qiáng)毒感染[17]。Cui等分離獲得PPV 2010株，經(jīng)基因組序列分析其或可作為自然減毒疫苗株[18]。2015年，張婉華等對實(shí)驗(yàn)室研制的弱毒疫苗進(jìn)行免疫效力評價(jià)和臨床免疫試驗(yàn)，豬接種7 d后全部產(chǎn)生抗體反應(yīng)，免疫豬攻毒后保護(hù)率達(dá)100%[19]。

由于弱毒疫苗存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)，在我國商業(yè)化較為困難，后續(xù)相關(guān)研究較少。

3 基因工程疫苗

在PPV的預(yù)防中，滅活疫苗和弱毒疫苗都起到了重要作用，但這2種疫苗均存在部分缺點(diǎn)，如滅活疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生時(shí)間較長、抗體水平不穩(wěn)定，弱毒疫苗存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)等。通過基因工程方法制備疫苗可以避免上述問題，為疫苗研究提供了新方法。

VP2是PPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，包含病毒主要抗原表位，且VP2可在體外組裝成病毒樣顆粒(Virus-like particle，VLP)，不含核酸但形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒粒子相似，具有高度的免疫原性和穩(wěn)定性，因此，基因工程疫苗相關(guān)研究多以VP2為主要方向。

3.1 基因工程亞單位疫苗 基因工程亞單位疫苗是指利用基因工程的方法將病原體的抗原基因在體外表達(dá)蛋白或多肽，以此作為免疫原制成的疫苗，該類疫苗安全性好、純度高。

1992年，Martínez等將PPV的VP2基因克隆至桿狀病毒系統(tǒng)并在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，所得產(chǎn)物可自行組裝成VLP[20]。李茜等選用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建含PPV AV30株衣殼蛋白VP2基因的重組桿狀病毒，感染草地貪夜蛾細(xì)胞(Spodoptera frugiperda cell，sf9)、High Five細(xì)胞表達(dá)VP2蛋白，免疫BALB/c小鼠，能刺激小鼠產(chǎn)生抗PPV的特異性抗體[3]。張雪花等和劉金鳳等在桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)VP2蛋白的基礎(chǔ)上添加了IFN-γ和人單純皰疹病毒1型VP22等，可進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)[21,22]。2021年，Zhao等使用N-2羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖作為佐劑，增強(qiáng)了豬細(xì)小病毒VP2亞單位疫苗在母豬體內(nèi)的免疫原性[23]。桿狀病毒表達(dá)PPV VLP疫苗的免疫效果較好，但其成本較高，許多研究者選擇了產(chǎn)量高、成本低的原核表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行研究。Guo等用畢赤酵母表達(dá)VP2蛋白制備的疫苗可引起小鼠特異性體液免疫反應(yīng)，添加佐劑可增強(qiáng)免疫原性[24]。Ji等報(bào)道了一種在共表達(dá)伴侶蛋白的原核系統(tǒng)中形成的VLP疫苗，可誘導(dǎo)小鼠和豚鼠產(chǎn)生中和抗體、HI抗體，還可刺激淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌[25]。2020年，Liu對PPV VP2和PCV2 Cap二聯(lián)亞單位疫苗進(jìn)行初步研究，該二聯(lián)疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫，2種蛋白混合乳化后未相互抑制，免疫效果與單苗相當(dāng)[26]。Wang等將優(yōu)化后的VP2基因克隆到pET28a載體并在大腸桿菌中表達(dá)，用ISA-201 VG佐劑制備疫苗免疫豬群，可產(chǎn)生與商業(yè)滅活疫苗相當(dāng)?shù)目贵w效價(jià)[27]。Hua等利用pCodII原核表達(dá)載體在大腸桿菌DE3細(xì)胞中表達(dá)可溶性重組VP2蛋白，生產(chǎn)的疫苗可對胎兒提供完全保護(hù)[28]。2021年，Yang等采用馬克斯克魯維酵母表達(dá)PPV VP2蛋白，結(jié)果顯示，該非傳統(tǒng)酵母平臺是迄今為止能獲得最高產(chǎn)量PPV VLP的途徑，具有產(chǎn)量高、速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)[29]。應(yīng)用原核和酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的蛋白產(chǎn)量高，但也需考慮蛋白空間構(gòu)象等問題，因此，研制基因工程亞單位疫苗時(shí)對于表達(dá)系統(tǒng)的選擇也很重要。

3.2 基因工程活載體疫苗 基因工程活載體疫苗是指將病原體的抗原基因構(gòu)建至另一病原體的基因組復(fù)制非必需區(qū)制備而成的疫苗。該類疫苗可隨載體在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制而不斷表達(dá)目的抗原，誘導(dǎo)免疫，且有一針防多病的效果。

PRV具有不感染人、基因組容量大、重組病毒遺傳穩(wěn)定等特點(diǎn)，適合改造成表達(dá)外源基因的活病毒表達(dá)載體。因此，PPV的基因工程活載體疫苗多選擇PRV為載體。洪琦將口蹄疫病毒衣殼蛋白前體P1-2A基因和PPVVP2基因共同插入到PRV載體，重組病毒可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)[30]。王新構(gòu)建了融合表達(dá)PCV2ORF2基因和PPVVP2基因的PRV載體病毒，重組病毒遺傳穩(wěn)定，可刺激小鼠產(chǎn)生較高的抗PRV、PCV2和PPV抗體水平[31]。2011年，Chen等以PRV為載體表達(dá)PPVVP2基因，重組病毒制備的疫苗免疫后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生PPV特異性抗體且顯著降低強(qiáng)毒PRV攻擊導(dǎo)致的死亡率，證實(shí)了重組病毒的安全性、免疫原性和保護(hù)效力[32]。陳第詩構(gòu)建了JEV-PPV-PRV活載體的三聯(lián)疫苗，免疫1次仔豬即可誘導(dǎo)較好的針對3種病毒的體液免疫應(yīng)答，并能誘導(dǎo)良好的Th1型和Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答[33]。付朋飛等研制出能夠同時(shí)預(yù)防PPV和PRV的二聯(lián)活載體疫苗，可促使小鼠產(chǎn)生抗PPV和PRV抗體，同時(shí)增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫反應(yīng)，對PRV強(qiáng)毒攻擊也具有保護(hù)作用[34]。2020年，Zheng等構(gòu)建了表達(dá)PPV VP2和IL-6的PRV載體疫苗，該疫苗免疫小鼠可產(chǎn)生PPV特異性抗體，顯著增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，還可誘導(dǎo)高水平的PRV中和抗體，可作為抗PPV和PRV的潛在候選疫苗[35]。然而，由于基因工程活載體疫苗整體基因組較大，產(chǎn)量難以提升，商品化應(yīng)用仍面臨一系列難題。

3.3 核酸疫苗 核酸疫苗也稱基因疫苗，將病原體的抗原基因克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒上，將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主體內(nèi)，使得宿主表達(dá)抗原蛋白，從而產(chǎn)生對應(yīng)免疫應(yīng)答。核酸疫苗接種后，其抗原在宿主體內(nèi)的遞呈過程與自然感染相似，可引起較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，且能攜帶多個(gè)抗原基因，可制成多價(jià)或多聯(lián)疫苗。

趙俊龍等分別構(gòu)建了PPVVP1和VP2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過肌肉注射途徑免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞和體液免疫，但聯(lián)合使用無加強(qiáng)作用[36]。魏戰(zhàn)勇研制PPV核酸疫苗后以小鼠為模型進(jìn)行抗體檢測，抗體滴度與活疫苗免疫后的小鼠基本一致[37]。2010年，張振梅構(gòu)建了共表達(dá)PCV2ORF2和PPVVP2基因的質(zhì)粒，重組質(zhì)粒肌肉注射可引起小鼠體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，安全性良好[38]。葉茂等用重疊PCR方法連接PPVVP2和JEVE10，并在載體上加入IFN-γ基因，發(fā)現(xiàn)加入IFN-γ可誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫記憶，持續(xù)刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體[39]。李云云等將PPVVP2基因與JEVEIII基因通過Linker連接后克隆至真核表達(dá)載體，小鼠在二免后1周可產(chǎn)生特異性抗體[40]。孫彥欣等將編碼T細(xì)胞表位P21多肽的序列連接PPVVP2基因5′端，克隆至表達(dá)質(zhì)粒，注射小鼠可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生明顯的抗體反應(yīng)，且顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖[41]。但是，由于DNA疫苗在體內(nèi)引起的免疫反應(yīng)較慢，不適合緊急接種，且外源基因可能整合到宿主DNA內(nèi)，從而產(chǎn)生不良影響，之后很少再有PPV核酸疫苗的相關(guān)報(bào)道。

近年來，研究者們進(jìn)一步著眼于PPV的分子生物學(xué)研究，期望從中找出可用于疫苗研發(fā)的新方向。2020年，Wang等通過計(jì)算機(jī)方法預(yù)測了PPV Cap的潛在B細(xì)胞抗原表位，這些表位可作為疫苗或血清學(xué)診斷方法開發(fā)的候選方向[42]。此外，Wang等鑒定了參與衣殼蛋白組裝的必需氨基酸，提出可通過替換VP2蛋白N末端的前47個(gè)氨基酸來設(shè)計(jì)嵌合VLP疫苗[43]。

4 展望

PPV在世界各國廣泛流行，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前沒有有效治療PPV的辦法，大多采用綜合防治措施進(jìn)行預(yù)防，如定期監(jiān)測、淘汰陽性豬、做好消毒、自繁自養(yǎng)、建立主動(dòng)免疫等。疫苗接種是當(dāng)前控制PPV的主要有效措施，但由于PPV強(qiáng)毒株、新毒株的不斷出現(xiàn)，PPV的預(yù)防面臨著新的挑戰(zhàn)。因此，加快PPV疫苗研究顯得尤為迫切。

國外使用的PPV疫苗有勃林格殷格翰生產(chǎn)的亞單位疫苗ReproCyc ParvoFLEX?、西班牙海博萊生物大藥廠生產(chǎn)的滅活疫苗ERYSENG?PARVO、默沙東有限公司生產(chǎn)的滅活多聯(lián)疫苗Porcilis Ery+Parvo+Lepto等[44]。我國由于考慮到生物安全等問題，目前使用的疫苗均為滅活疫苗，但滅活疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體所需時(shí)間長，抗體水平往往不如基因工程疫苗。此外，使用滅活疫苗免疫后，豬群仍有可能持續(xù)排毒，不斷感染，不利于養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。我國的基因工程PPV疫苗僅限于實(shí)驗(yàn)室研究，尚未商品化應(yīng)用。其中，PPV亞單位疫苗相比活載體疫苗和核酸疫苗更安全，且產(chǎn)量更易提高，相關(guān)研究也最多。PPV亞單位疫苗可選擇不同表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，且近年來研究者們并不再只關(guān)注VP2單個(gè)基因，提供了更多疫苗研究的可能性。相信隨著對PPV的深入研究和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，PPV新型疫苗有望在不久的將來研制成功。