液相色譜-串聯質譜法同時測定牛奶和羊奶中43種藥物殘留

張建偉，彭 麗，張盼盼，吳寧鵬，孟 蕾，趙晨浩，吳志明，程相朝

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023 ； 2. 河南省獸藥飼料監察所，河南 鄭州 450008 ；3. 河南農業大學動物醫學院，河南 鄭州 450046)

奶作為人類優質蛋白的重要來源，在居民膳食結構中占有重要地位。隨著人們生活水平的提高和市場需求的增多，奶牛和奶羊的養殖規模也不斷的增加和擴大。獸藥作為畜牧養殖業的重要投入品，在養殖過程占據重要的地位和角色。但是，濫用或不合理使用獸藥會導致奶中藥物殘留超標，進而通過食物鏈在人體富集，對人體造成毒性作用，危害人體健康[1-5]。為保障乳品安全，我國于2019年發布了《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650—2019)并規定了奶中喹諾酮類、磺胺類、四環素類等獸藥的最大殘留限量[6]，為奶中獸藥殘留的監管提供了依據。

獸藥殘留檢測是保障乳品質量安全的重要監管手段和措施。目前，奶中獸藥殘留常用的檢測方法有微生物法[7,8]、酶聯免疫吸附法[9,10]、膠體金免疫層析法[11,12]、核酸適配體檢測法[13,14]等。以上方法準確度不高、存在假陽性，對于多藥物殘留同時檢測具有一定局限性。近年來，液相色譜-串聯質譜法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)以其高靈敏度、高準確性等特點被廣泛用于奶中獸藥殘留檢測[15-17]。但因獸藥種類多，不同種類獸藥之間理化性質差異大，同時檢測多種類藥物難度大，現有奶中獸藥殘留檢測方法多是檢測單類藥物，難以滿足多種類藥物同時測定的需求。因此，有必要建立一種同時檢測奶中多種類獸藥殘留的方法。

本試驗采用液相色譜-串聯質譜法，對色譜和質譜條件進行了優化，考察了多種提取和凈化條件，建立了牛奶和羊奶中β-內酰胺類、大環內酯類、磺胺類、喹諾酮類、林可胺類、四環素類、性激素類和抗蟲類共8大類43種藥物(47種殘留標志物)同時檢測的方法，對提升奶中獸藥殘留檢測能力，促進乳品質量安全建設具有實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、頭孢氨芐、紅霉素A、替米考星、達氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、氟甲喹、林可霉素、金霉素、四環素、土霉素、醋酸氟孕酮、咪多卡、氯羥吡啶、硝碘酚腈、阿苯達唑、阿苯達唑-2-氨基砜、噻苯達唑(純度≥84%，中國獸醫藥品監察所)；泰樂菌素A、阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜(1 mg/mL，天津阿爾塔科技有限公司)；吡利霉素、5-羥基噻苯達唑、21種磺胺類藥物混合標準溶液(100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司)；甲醇、乙腈、甲酸(色譜純,德國默克股份兩合公司)；甲酸銨、氨水、二水乙二胺四乙酸二鈉、一水檸檬酸、十二水磷酸氫二鈉(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)。

1.2 儀器與設備 TSQ Quantiva液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；IKA MS3 Basic渦旋混合器(艾卡廣州儀器設備有限公司)；TARGIN TECH VX-03型多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；TTL-DC Ⅱ型氮吹儀(美國Organomation Associates公司)；LYNX4000高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；ME204T電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；Milli-Q去離子水發生器(美國Millipore公司)。

1.3 溶液配制 標準儲備液：分別準確稱取適量標準品于10 mL容量瓶中，加適量助溶劑溶解后用甲醇溶解并定容，配制成濃度均為1 mg/mL的單標儲備液。

混合標準中間工作液：分別移取適量同類別藥物標準儲備液，用甲醇稀釋并定容，配成濃度均為10 μg/mL的β-內酰胺類、大環內酯類、磺胺類、喹諾酮類、林可胺類、四環素類、性激素類和抗蟲類混合標準中間工作液。

Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液：分別稱取一水檸檬酸2.59 g，十二水磷酸氫二鈉5.52 g，二水乙二胺四乙酸二鈉7.44 g，加去離子水180 mL溶解，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至4.0 ± 0.5，用去離子水稀釋至200 mL，混勻。

1.4 測定方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：A相為甲醇，B相為10 mmol/L甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.4.2 質譜條件 采用電噴霧電離(Electrospray ionization,ESI)和多反應監測(Multiple reaction monitoring,MRM)模式。噴霧電壓：3.0 kV(ESI+)、2.5 kV(ESI-)；鞘氣：15 Arb(ESI+)、35 Arb(ESI-)；輔助氣：5 Arb；離子傳輸管溫度：320 ℃；霧化溫度：320 ℃；目標物保留時間、母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量參考值見表2。硝碘酚腈掃描模式為負離子，其余藥物及殘留標志物掃描模式均為正離子。

表2 43種藥物與其對應殘留標志物的質譜條件參數

1.4.3 樣品前處理過程 提取：取試樣液(奶)1 g于15 mL離心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液200 μL，1%氨化乙腈1 mL，渦旋30 s，再加入1%氨化乙腈3 mL，振蕩10 min，4 ℃下10 000 r/min離心5 min，移取上清液至另一離心管中。殘渣中加入90%乙腈(含0.5%乙酸) 4 mL重復提取，合并上清液，作為備用液。凈化：上清液在40 ℃下氮吹至體積小于0.5 mL，加入甲醇200 μL，渦旋30 s，加水定容至1.0 mL，超聲1 min，渦旋混勻，轉移至1.5 mL離心管中，-20 ℃冷凍1 h，于4 ℃下20 000 r/min離心20 min。上清液過微孔尼龍濾膜，供液相色譜-串聯質譜測定。

1.4.4 基質匹配標準曲線繪制 取空白試樣液，按1.4.3中提取步驟處理得到空白基質備用液，分別準確移取適量混合標準中間工作液，加入空白基質備用液中，按1.4.3中凈化步驟處理，配制成濃度為0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100和200 ng/mL的系列基質匹配標準溶液。以各藥物特征離子色譜峰面積為縱坐標，基質匹配標準溶液濃度為橫坐標，繪制基質匹配標準曲線。

1.4.5 定性和定量分析 在同樣測試條件下，試樣液中待測物藥物峰的保留時間與基質匹配標準溶液相應峰的保留時間相對偏差在±2.5%以內，且檢測到的離子的相對豐度比應與濃度相當的基質匹配標準溶液的相對豐度比一致，容許偏差達到歐盟2002/657/EC中的規定[18]。定量方法采用外標法定量。

1.4.6 靈敏度測定 將適量混合標準中間工作液加入到空白試樣液中，按1.4.3步驟進行前處理后，上機檢測，觀察藥物特征離子質量色譜峰信噪比(S/N)和對應藥物濃度，依據信噪比S/N>10確定本方法在牛奶和羊奶中的定量限(Limit of quantitation,LOQ)。

1.4.7 回收率和精密度測定 采用標準添加法，在空白牛奶、羊奶中添加適量混合標準中間工作液，制成添加濃度分別為LOQ、1/2最大殘留限量(Maximum residue limit,MRL)、MRL、2MRL的陽性添加樣品，各添加水平進行5個樣品平行試驗，求得平均回收率和相對標準偏差(Relative standard deviation,RSD)。各藥物MRL參照GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》[6]。

2 結果

2.1 基質匹配標準曲線 按照1.4.4中系列基質匹配標準溶液濃度進行線性回歸，得到的回歸方程和相關系數如表3所示，47種殘留標志物在0.2～200 ng/mL的濃度范圍內呈現良好的線性關系，相關系數R2均大于0.990。

表3 47種殘留標志物線性范圍、定量限、回歸方程和相關系數

續表

2.2 靈敏度測定 依據信噪比S/N>10，確定本方法的定量限。如表3所示，本方法在牛奶和羊奶中的定量限為0.5～5 μg/kg，具有較好的靈敏度。47種殘留標志物總離子流色譜圖如圖1所示，47種殘留標志物響應強度高，分離度良好。

圖1 混合對照品總離子流色譜圖

2.3 回收率和精確度測定 結果如表4所示，牛奶和羊奶樣品中47種殘留標志物在0.5～200 μg/kg添加濃度范圍內，平均回收率介于61.4%～115.7%，相對標準偏差介于1.2%～11.4%，表明該方法具有良好的回收率和精確度，符合多殘留分析要求。

3 討論

3.1 色譜條件的優化 通過比較多藥物殘留檢測中常用的乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-10 mmol/L甲酸銨、乙腈-10 mmol/L甲酸銨等流動相體系，發現水相中加入0.1%甲酸能夠增強磺胺類、喹諾酮類等大部分藥物的離子化效率，使峰形更加對稱、尖銳，而加入甲酸銨可以顯著提高氯羥吡啶等藥物響應。對比發現，選擇甲醇-10 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)作為流動相，待測物出峰情況較為理想。

3.2 提取劑的優化 奶中的蛋白質不僅會干擾待測物的測定，還會引起儀器進樣口堵塞等問題，因此需將蛋白質進行沉淀[19,20]。本方法對0.1%甲酸-乙腈、0.2%甲酸-乙腈和1%氨水-乙腈3種不同的提取液進行考察，結果顯示，1%氨水-乙腈作為提取液時，47種殘留標志物總體回收率較好。進一步對提取液用量進行考察，以1倍、2倍、3倍和4倍樣品體積的提取液進行提取，結果顯示，提取液和樣品比例達到4∶1時，蛋白沉淀效果最好。由于抗蟲類藥物回收率偏低，考慮到同一種提取液難以兼顧所有種類藥物，故采用兩次提取方式以提高待測物回收率。比較了0.5%乙酸乙腈、90%乙腈、90%乙腈(含0.5%乙酸)的第2次提取效果，最終選用90%乙腈(含0.5%乙酸)作為第2次提取液效果最好。

3.3 凈化條件的優化 牛奶和羊奶基質復雜，除含有較多的蛋白質外，還有磷脂等親脂性雜質、碳水化合物和少量礦物質等，因此必須對樣品進行凈化以減少基質影響[21]。常用的凈化方法有固相萃取法、正己烷除脂法和低溫冷凍法等，其中，固相萃取法考察了常用的HLB、PEP-2、X-HLB柱。經過比較試驗，本方法采用低溫冷凍凈化，可以有效去除奶中大部分基質干擾，且省去了過柱等繁瑣步驟，有利于實際樣品分析檢測。

本試驗采用液相色譜-串聯質譜法建立了同時測定牛奶和羊奶中β-內酰胺類、大環內酯類、磺胺類、喹諾酮類、林可胺類、四環素類、性激素類、抗蟲類共8大類43種藥物殘留的檢測方法。該方法對47種殘留標志物的質譜和色譜條件進行了優化，對提取和凈化條件進行了探索，實現了牛奶和羊奶中47種殘留標志物的定性和定量分析。與傳統獸藥殘留檢測方法相比，本方法省去了過柱等繁瑣步驟，可同時對奶中43種獸藥殘留進行檢測，具有操作簡單、檢測效率高等優點，可為奶中獸藥殘留監管提供有力技術支撐。