雞源彎曲菌毒力基因和耐藥性的相關性

李 軒，謝 春，周 藜，汪淑穎，向婧姝，黃靖宇，王翠桑，向 紅

(1.貴州省疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550004 ；2.貴州醫科大學公共衛生與健康學院 環境污染與疾病監控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

彎曲菌(Campylobacterspp.)是一種革蘭陰性微需氧菌，是重要的人獸共患病原菌之一，該菌可長期存活于禽類腸道并持續向外排菌。抗菌藥在畜牧業中的大量使用甚至是濫用對包括彎曲菌在內的病原菌產生了選擇性壓力，將促使“超級細菌”出現，影響抗菌藥治療的有效性。目前耐藥彎曲菌已被世界衛生組織(WHO)指定為開發新抗菌藥療法的高度優先病原體之一[1,2]。毒力和耐藥性可能不是相互獨立的特性，抗菌藥的使用不僅會導致病原菌耐藥性增強，同時與毒力因子存在正向或負向關聯[2]，鮮有研究分析彎曲菌毒力因子與耐藥性間是否具有相關性。抗菌藥耐藥性的存在和毒力因子對疾病的發展都很重要，需要進一步研究毒力因子與抗菌藥耐藥性之間的相互作用，以便更好地了解彎曲菌致病的本質。

本研究以貴州省9個市(州)的雞源彎曲菌分離株為研究對象，調查毒力基因攜帶和耐藥現狀，對比分析耐藥株與敏感株在統計學上攜帶毒力基因的差異，評估耐藥表型與毒力基因相關性，以期為彎曲菌致病機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 在貴州省9個市(州)中隨機抽取養雞場，共采集新鮮的雞糞便樣本220份，放入Cary-Blair運送培養基中，4 ℃條件下送至實驗室；采用雙孔板驅動增強法[3]分離培養彎曲菌，經生化和生物質譜檢測系統鑒定后，共獲得96株彎曲菌分離菌株。

1.2 主要儀器 全自動快速生物質譜檢測系統(Microflex LT/SH MALDI-MS System)，布魯克(北京)科技有限公司產品；T100梯度PCR擴增儀、PowerPac Basic電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統，均為美國Bio-Rad公司產品。

1.3 主要試劑 彎曲菌培養檢測試劑盒(ZC-CAMPY-001)、彎曲菌瓊脂稀釋法抗菌藥最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)檢測試劑盒(ZC-AST-001)、彎曲菌生化檢測試劑盒(ZC-CAMPY-010)，均購自青島中創匯科生物科技有限公司；PremixTaq(TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 毒力基因檢測 參照參考文獻[4]設計flaA、ciaB、virB11、cdtA、cdtC、wlaN、fur、katA、cadF、cheY、cdtB、sodB共12個毒力基因引物，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列見表1。cadF和cheY、cdtB和sodB兩組的雙重PCR反應體系及其余8個毒力基因的PCR反應體系：2×PremixTaq12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，無菌ddH2O補足至25.0 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；最后72 ℃延伸5 min。取1 μL擴增產物加樣于1.0% 瓊脂糖凝膠中，120 V電壓下電泳20 min，通過凝膠成像系統成像。

表1 毒力基因引物信息

1.5 藥敏試驗 參照美國臨床實驗室標準化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的瓊脂稀釋法(Agar dilution method)，使用彎曲菌瓊脂稀釋法抗菌藥最低抑菌濃度(MIC)檢測試劑盒進行藥敏試驗，抗菌藥物包含7類11種，以空腸彎曲菌(ATCC33560)和結腸彎曲菌(ATCC43478)作為質控菌株。42 ℃微需氧培養24 h后讀取MIC值。若數量較多的菌株分布在MIC范圍的低值區，則耐藥率低；若數量較多的菌株分布在MIC范圍的高值區，則耐藥率高；但具體判斷某株菌的耐藥情況是依據在MIC范圍內的耐藥折點值。紅霉素、環丙沙星、四環素的敏感性判定依據CLSI M45-3rd版[5]，而其余抗菌藥的敏感性判定依據美國國家耐藥性監測系統(National Antimicrobial Resistance Monitoring System,NARMS) (https://www. cdc. gov/narms/antibiotics-tested.html)和歐洲藥敏試驗委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)[6]的推薦標準。空腸彎曲菌對各抗菌藥耐藥折點值：紅霉素(≥32 mg/L)、萘啶酸(≥32 mg/L)、氯霉素(≥32 mg/L)、鏈霉素(≥16 mg/L)、四環素(≥16 mg/L)、泰利霉素(≥8 mg/L)、氟苯尼考(≥8 mg/L)、環丙沙星(≥4 mg/L)、慶大霉素(≥4 mg/L)、克林霉素(≥1 mg/L)、阿奇霉素(≥0.5 mg/L)，結腸彎曲菌對抗菌藥耐藥折點值除阿奇霉素(≥1 mg/L)和克林霉素(≥2 mg/L)外，其他與空腸彎曲菌相同。

1.6 統計學分析 運用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。通過計算Cramer's V系數分析各種抗菌藥耐藥性與毒力基因的關系，該系數的取值范圍為0～1，越接近1表示相關性越強，Cramer's V系數<0.3表示相關性較弱，0.3≤Cramer's V系數≤0.6表示中度相關，Cramer's V系數>0.6表示相關性較強。

2 結果

2.1 毒力基因檢測 通過PCR方法檢測96株彎曲菌分離株(空腸彎曲菌34株、結腸彎曲菌62株)中12個毒力基因的攜帶情況，結果顯示，彎曲菌中sodB基因的攜帶率最高(99.0%)；其次是cheY、fur，攜帶率均為96.9%；cadF基因的攜帶率為89.6%；virB11和ciaB的攜帶率均為0。cdtA、cdtB、cdtC在空腸彎曲菌中的檢出率極顯著高于在結腸彎曲菌中的檢出率(χ2=32.500，χ2=35.855，χ2=24.525，P<0.01)，katA在結腸彎曲菌中的檢出率顯著高于在空腸彎曲菌中的檢出率(χ2=7.521，P<0.05)(圖1，表2)。

圖1 彎曲菌分離株毒力基因的PCR擴增

表2 毒力基因在彎曲菌中的分布

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2.2 毒力基因譜分析 將96株彎曲菌分離株的毒力基因攜帶情況構建毒力基因譜，其中空腸彎曲菌分離株共15個譜型，結腸彎曲菌分離株共18個譜型；空腸彎曲菌優勢毒力基因譜為flaA-cadF-cheY-cdtA-cdtB-cdtC-fur-katA-sodB(20.6%)，結腸彎曲菌優勢毒力基因譜為flaA-cadF-cheY-fur-katA-sodB(37.1%)；同時攜帶6種及以上毒力基因的彎曲菌占76.04%，其中空腸彎曲菌占31.3%(30株)，結腸彎曲菌占44.8%(43株)(表3)。

表3 彎曲菌分離株毒力基因譜及其所占比例

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2.3 耐藥分析 利用瓊脂稀釋法進行藥敏試驗，96株彎曲菌分離株對11種抗菌藥存在不同程度的耐藥。對萘啶酸耐藥率最高(91.6%)，其次為四環素(88.5%)、環丙沙星(82.2%)；對氟苯尼考最敏感(3.1%)；空腸彎曲菌和結腸彎曲菌在耐藥水平和MIC分布上存在差異，其中空腸彎曲菌對萘啶酸(88.2%)的耐藥率最高，其次為四環素(85.2%)、環丙沙星(73.5%)；結腸彎曲菌對萘啶酸(93.5%)、四環素(90.3%)、環丙沙星(87.0%)的耐藥率較高；結腸彎曲菌在紅霉素、阿奇霉素、鏈霉素、氯霉素、泰利霉素和克林霉素中的MIC50、MIC90值均高于空腸彎曲菌(表4)。結腸彎曲菌分離株對紅霉素(χ2=9.702，P<0.05)、阿奇霉素(χ2=14.877，P<0.05)、慶大霉素(χ2=8.104，P<0.05)、鏈霉素(χ2=11.021，P<0.05)、泰利霉素(χ2=11.671，P<0.05)和克林霉素(χ2=6.001，P<0.05)的耐藥率顯著高于空腸彎曲菌，其他抗菌藥(萘啶酸、環丙沙星、氯霉素、氟苯尼考、四環素)在空腸彎曲菌和結腸彎曲菌間無統計學差異(P>0.05)。

表4 96株彎曲菌對11種抗菌藥的體外抗菌活性比較

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2.4 毒力基因與耐藥表型的相關性 通過計算Cramer's V值分析彎曲菌耐藥性與毒力基因的相關性，發現紅霉素與cdtC基因(0.252)，阿奇霉素與cdtA(0.242)、cdtB基因(0.218)，環丙沙星與cdtB(0.272)、cdtC(0.373)、wlaN基因(0.409)，鏈霉素與cdtA(0.295)、cdtB(0.284)、cdtC(0.298)、wlaN基因(0.215)，氯霉素與flaA基因(0.204)，四環素與fur基因(0.427)存在弱相關；未發現其他抗菌藥耐藥性與毒力基因存在關聯(表5)。

表5 雞源彎曲菌分離株耐藥性與毒力基因的相關性

3 討論

本試驗中雞源彎曲菌分離株編碼細胞致死性膨脹毒素的cdtA、cdtB、cdtC基因檢出率在40%以上，低于國內外研究結果[7,8]，這3個相鄰基因在空腸彎曲菌中的檢出率均顯著高于結腸彎曲菌，與Bardoň等[9]的研究一致，該差異是否與空腸彎曲菌較強的致病性相關還需進一步研究。編碼鞭毛蛋白的flaA基因在彎曲菌的定殖中起重要作用，雖然該基因被認為是一個保守基因，但并非在所有菌株中都可檢出[10]。本試驗分離株的flaA攜帶率為61.5%，低于Nguyen等[11]和Fraz?o等[12]的報道；影響細菌粘附和定殖的質粒基因virB11檢出率為0，與Wieczorek等[13]研究結果一致；編碼侵入抗原蛋白的ciaB檢出率為0，與翟海華等[14]報道中的高檢出率相反；wlaN基因編碼β-1,3-半乳糖轉移酶，與格林巴利綜合征的發生密切相關[15]，該基因檢出率為13.5%，與Wieczorek等[13]的結果相近，但空腸彎曲菌和結腸彎曲菌中wlaN檢出率無顯著差異，與唐夢君等[8]研究結果不同；其余5種毒力基因在分離株中有較高的檢出率，與相關研究結果一致[16，17]。本試驗分析發現，結腸彎曲菌毒力譜型多于空腸彎曲菌，同時攜帶6種及以上毒力基因的結腸彎曲菌數多于空腸彎曲菌，但空腸彎曲菌的優勢譜所含毒力基因類型多于結腸彎曲菌，不可忽視結腸彎曲菌引起疾病的能力。

由于中國、南非等國家彎曲菌分離株對大環內酯類藥物耐藥性的上升，引起了人們將大環內酯類抗菌藥作為一線治療藥物的擔憂[18,19]，而本試驗分離株對大環內酯類抗菌藥耐藥率低于40%；與空腸彎曲菌相比，結腸彎曲菌對大環內酯類藥物的耐藥率較高，與上海[20]、徐州[21]的研究一致。對氟喹諾酮類藥物的耐藥現狀同樣不容忽視，本試驗中彎曲菌對萘啶酸和環丙沙星的耐藥率高達80%以上，與突尼斯北部[22]、意大利[23]的研究結果一致，但低于對我國5個省市雞源彎曲菌的耐藥率結果，不同地區研究結果間的差異可能與當地家禽養殖過程中所施用抗菌藥的情況有關[24]。當前嚴重的耐藥情況可能與彎曲菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制有關，研究發現，在家禽養殖中未使用氟喹諾酮類抗菌藥時耐藥菌株可能仍存在，甚至耐藥率可增至15%[25]。此外，本試驗根據抗菌藥抑菌濃度結果發現，結腸彎曲菌對抗菌藥的耐藥性高于空腸彎曲菌。結合結腸彎曲菌具備嚴重多重耐藥的現狀，需重視該菌種所引起彎曲菌病可能帶來的額外風險。

目前，盡管彎曲菌的致病機制尚不清楚，但毒力與臨床感染可能具有相關性，毒力因子也可能與耐藥性有關[26]。Almofti等[27]通過體外誘變試驗發現，與紅霉素敏感株相比，耐藥株對腸上皮細胞和小鼠巨噬細胞的粘附、侵襲性明顯降低。由于多種毒力基因在感染機體導致疾病過程中參與表達毒力因子并發揮作用，但關注毒力基因與耐藥性之間相互影響的研究較少。本試驗從與致病相關的毒力基因角度初步分析了耐藥性與毒力基因的關系，結果顯示，抗菌藥耐藥性與部分毒力基因的存在有較弱的相關性，這與Raeisi等[28]的研究結果相似；而ciaB毒力基因與環丙沙星、紅霉素耐藥性表達存在相互影響[29]，但未發現ciaB毒力基因與其耐藥性有顯著的相關性。因此，毒力基因與耐藥性的關聯性需要在分子水平上進一步研究。

綜上所述，本試驗發現貴州省雞源彎曲菌分離株毒力基因普遍存在，菌株耐藥情況嚴重，部分毒力基因與耐藥性之間存在弱相關，這可為評估與控制病原彎曲菌引起的風險提供參考依據。下一步可應用全基因組分析、構建基因突變體、蛋白互相作用等分子生物學技術深入闡明毒力基因與耐藥性關聯的內在規律，以預防和控制彎曲菌感染。