6種非洲豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒的比較

王麗萍，臧京帥，丁 凱，張 麗，蘇 瑩，龔振華，張鶴曉

(1.北京森康生物技術開發有限公司，北京 懷柔 101400 ； 2. 中國動物衛生與流行病學中心，山東 青島 266032 ； 3.中國海關科學技術研究中心，北京 朝陽 100026)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性的傳染病，其發病率高，死亡率可達100%，世界動物衛生組織(World Organization for Animal Health，OIE)將其列為必須報告動物疫病[1]。1921年ASF在肯尼亞首次發生[2]，2018年8月我國遼寧省沈陽市首次報告ASF疫情[3]。由于目前尚無有效的ASF疫苗，撲殺政策仍是防控和根除ASF的最佳選擇和最有效措施，因此快速、準確的診斷對該病確診、控制和根除十分重要。現階段各豬場主要采用熒光定量PCR方法進行ASFV檢測，但目前ASFV基因缺失株、自然變異株、自然弱毒株等變異株頻繁出現，給豬場ASFV檢測帶來新的挑戰，這些毒株排毒量低、間歇性排毒，易造成抗原檢測漏檢[4]，因此，可采用抗體檢測與抗原檢測相互印證來進一步判斷ASFV感染情況。ASF血清學抗體檢測常用的方法有酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫印跡試驗(Immunoblot，IB)、間接熒光抗體(Indirect fluorescent antibody，IFA)和免疫過氧化物酶試驗(Immune peroxidase test，IPT)，其中ELISA是OIE指定的ASF首選血清學診斷方法，其方便快速、敏感特異，并可使用自動化設備檢測大量樣本，為目前最廣泛的血清學檢測技術[5-7]。根據文獻報道具有診斷學意義的蛋白主要有p72、p54、p30、pA104R、pK205R、p62、pB602L等，其中p72、p54、p30是應用較為廣泛的3種蛋白，具有較高的免疫原性，用于制備的ELISA檢測試劑盒均具有較好的敏感性和特異性[8-13]。

目前市售的非洲豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒比比皆是，但缺乏檢測效果的比較研究。因此，本試驗用已知背景的血清對6種市售的國產和進口試劑盒的敏感性、特異性和重復性進行了比較分析，為臨床中ASFV試劑盒選用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗體檢測試劑盒 試劑盒A：非洲豬瘟病毒間接ELISA 抗體檢測試劑盒，為北京某公司產品；試劑盒B：非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒，為法國某公司產品；試劑盒C：非洲豬瘟病毒競爭ELISA抗體檢測試劑盒，為法國某公司產品；試劑盒D：非洲豬瘟病毒阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒，為西班牙某公司產品；試劑盒E：非洲豬瘟病毒阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒，為杭州某公司產品；試劑盒F：非洲豬瘟病毒(ASFV)阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，為北京某公司產品。其中試劑盒A、E、F為國產試劑盒，已通過中國動物疫病預防控制中心比對試驗獲批上市；試劑盒B、C、D為進口試劑盒，未獲得國內批準文號，但市場應用較多。

1.1.2 血清

1.1.2.1 ASFV陽性血清 購自中國獸醫藥品監察所。

1.1.2.2 特異性血清 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)陽性血清、豬偽狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)陽性血清、豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)陽性血清、豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)陽性血清、豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)陽性血清、豬口蹄疫病毒(Foot-mouth disease virus，FMDV)陽性血清、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)陽性血清，均由北京森康生物技術開發有限公司提供。

1.1.2.3 臨床陽性血清 經非洲豬瘟病毒間接免疫熒光試驗檢測均為陽性，來自山東、河北、江蘇等地豬場，由中國動物衛生與流行病學中心提供，共48份。

1.1.2.4 臨床陰性血清 共279份。包括147份2015—2017年收集的血清，來自山東、河南等地豬場；132份2021年未感染非洲豬瘟的豬場血清(非洲豬瘟病毒間接免疫熒光試驗檢測陰性)，其中種公豬血清36份，懷孕母豬血清41份，仔豬血清25份，育肥豬血清30份，來自河北某豬場。

1.2 方法

1.2.1 敏感性比較

1.2.1.1 分析敏感性比較 由于各試劑盒要求的血清樣品稀釋倍數不同(2倍、20倍或50倍等)，為平行比較各試劑盒分析敏感性差異，本試驗將ASFV陽性血清按1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024和1∶2 048進行稀釋，取稀釋好的樣品再分別按照6種試劑盒各自的說明書進行倍數稀釋后檢測，分析不同試劑盒的最低檢出量(試劑盒說明書中的樣品稀釋倍數不計入)。

1.2.1.2 診斷敏感性比較 將48份臨床陽性血清分別用6種試劑盒進行檢測，比較陽性檢出率。

1.2.2 特異性比較

1.2.2.1 分析特異性比較 將特異性血清分別用6種試劑盒進行檢測，計算陰性率，比較分析特異性。

1.2.2.2 診斷特異性比較 將279份臨床陰性血清分別用6種試劑盒進行檢測，計算陰性率，比較診斷特異性。

1.2.3 批內重復性比較 每種試劑盒分別取批內的3個盒子，根據1.2.1.2和1.2.2.2的結果選擇5份強陽性、5份弱陽性和5份陰性血清進行檢測，每份血清重復4孔，根據OD平均值計算批內變異系數(CV%)并進行比較。

2 結果

2.1 敏感性比較

2.1.1 分析敏感性比較 對不同稀釋度的ASFV陽性血清進行檢測，結果見表1，試劑盒B、D、E、F最低檢出量均為1∶512；試劑盒C最低檢出量為1∶256；試劑盒A最低檢出量為1∶128。試劑盒B、D、E、F分析敏感性最高，試劑盒C次之，試劑盒A最低。

表1 6種試劑盒對不同稀釋度ASFV陽性血清的檢測結果

2.1.2 診斷敏感性比較 分別用6種試劑盒對48份臨床陽性血清進行檢測，結果見表2，試劑盒A的陽性檢出率為88%(42/48)、試劑盒B的陽性檢出率為96%(46/48)、試劑盒C的陽性檢出率為90%(43/48)、試劑盒D的陽性檢出率為94%(45/48)、試劑盒E的陽性檢出率為92%(44/48)、試劑盒F的陽性檢出率為94%(45/48)。陽性檢出率比較結果為：試劑盒B>試劑盒D、F>試劑盒E>試劑盒C>試劑盒A。

表2 6種試劑盒陽性檢出率

2.2 特異性比較

2.2.1 分析特異性比較 6種試劑盒對7份特異性質控血清的檢測結果均為陰性，結果見表3。

2.2.2 診斷特異性比較 對279份臨床陰性血清進行檢測，結果見表3，試劑盒A的陰性率為100%(279/279)、試劑盒B的陰性率為97%(270/279)、試劑盒C的陰性率為100%(279/279)、試劑盒D的陰性率為100%(279/279)、試劑盒E的陰性率為98%(274/279)、試劑盒F的陰性率為99%(277/279)。陰性率比較結果為：試劑盒A、C、D>試劑盒F>試劑盒E>試劑盒B。其中假陽性結果主要集中在2021年的血清，進一步對2021年采集的血清的類型進行了統計分析，132份血清中種公豬血清36份，懷孕母豬血清41份，仔豬血清25份，育肥豬血清30份，結果發現,假陽性血清主要集中在種公豬和懷孕母豬，以試劑盒B、E居多(圖1)。

表3 6種試劑盒對臨床陰性血清的檢測結果

圖1 2021年血清的陰性率分析

2.3 批內重復性比較 對15份血清進行批內重復性檢測，結果見表4，試劑盒A的CV%在1.18%～11.03%，試劑盒B的CV%在0.80%～9.98%，試劑盒C的CV%在0.59%～10.22%，試劑盒D的CV%在0.96%～9.74%，試劑盒E的CV%在1.29%～10.32%，試劑盒F的CV%在1.07%～9.96%，6種試劑盒的CV%均在15%以內。

表4 批內重復性試驗結果

3 討論

本試驗對6種非洲豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒進行了比較分析，結果發現，雖然各試劑盒的包被抗原不同，但在敏感性、特異性和批內重復性方面相差無幾。由于部分試劑盒無法購買到3個批次的產品，因此未進行批間重復性比較研究。

本試驗對各試劑盒檢測結果分析發現，6種試劑盒均存在假陽性或假陰性的情況，出現假陽性的血清，主要是來源于懷孕母豬和種公豬。分析原因可能是因為高齡豬均長期免疫各種亞單位疫苗，而生產亞單位疫苗的表達體系中也存在各種蛋白，包含的各種細菌蛋白、細胞蛋白或載體蛋白等隨疫苗打入豬體內后可能產生相應的抗體，從而導致假陽性產生[14]。對于非洲豬瘟病毒間接免疫熒光試驗檢測陽性的臨床血清，ELISA檢測陽性率在88%～96%。考慮到間接免疫熒光試驗是將ASFV全病毒進行固定，而各試劑盒是包被的各種蛋白，且每種蛋白抗體產生時間和持續時間不同，另外，間接免疫熒光是通過人為判定結果，可能也存在一定的誤差，因此，各試劑盒陽性檢出率未達到100%。另外，可采用抗體檢測與抗原檢測相互印證來判斷ASFV感染情況。聯合國糧農組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)《非洲豬瘟：檢測和診斷-獸醫指導手冊》中指出，“由于感染動物所處的感染期不同，因此在疫情和控制/根除計劃中，需要同時檢測病毒和抗體以確保準確性。根據報道，ASF的自然感染潛伏期為4～19 d。感染后7～9 d血清轉陽，抗體陽性可持續終生”[15]。

由于進口試劑盒質量較為穩定，近幾年國內ELISA抗體檢測主要依賴于進口試劑盒。從2020年以來，我國政策重點鼓勵診斷行業的發展，從本試驗結果可以看出，國產試劑盒的質量得到了大幅提高，非洲豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒可實現由國產替代進口。目前，國內診斷市場快速擴容，國產試劑盒崛起，我國獸用診斷制品正朝著實現國產化和進一步走向國際化的方向發展。