H7亞型禽流感病毒微滴式數字PCR檢測方法的建立及應用

蔣文明，李金平，尹 馨，彭 程，劉 朔，李 陽，于曉慧，王靜靜，劉華雷

[中國動物衛生與流行病學中心 農業農村部動物生物安全風險預警及防控重點實驗室(南方)，山東 青島 266032]

2013年3月，我國發生人間H7N9感染病例，同時家禽中也檢測到H7N9病毒，雖然動物試驗證明從家禽中分離到的H7N9病毒對家禽是無致病力的，但還是給家禽業造成了巨大的經濟損失[1,2]。隨著H7N9病毒的演變，2017年以來，H7N9亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)由弱毒株變異為強毒株，并導致多地暴發了H7N9亞型高致病性禽流感疫情[1,2]。免疫疫苗后疫情雖然得到有效控制，但家禽疫情仍時有發生，對H7N9及早做出診斷是切實做好疫病防控和保障養禽業健康發展的重要基礎。因此，建立H7N9亞型AIV的快速檢測方法是十分必要的。

目前AIV的分子診斷主要依靠反轉錄-聚合酶鏈式反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和熒光定量RT-PCR方法[3]。RT-PCR檢測時容易造成實驗室污染且只能定性檢測，敏感性也相對較低；熒光定量RT-PCR方法在定量分析時需要使用標準品建立標準曲線。更準確和更靈敏的檢測技術是分子檢測的發展方向，與第1代普通PCR和第2代熒光定量PCR相比，數字PCR作為第3代PCR技術，在檢測復雜來源樣品中極低含量核酸分子和直接絕對定量方面具有無可比擬的檢測優勢[4]。數字PCR主要原理是通過DNA有限稀釋法和泊松分布的統計原則來準確計算DNA的濃度，大大降低了體系中反應抑制因子的影響[5]。目前數字PCR已廣泛應用到病原微生物檢測和標準物質研究等研究領域[6-14]。根據數字PCR反應單元形成的原理，目前其主要分為3種：微滴式數字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)、芯片式數字PCR和微流控芯片式數字PCR[15]。本研究通過對ddPCR檢測H7亞型AIV的引物和探針濃度、退火溫度、升降溫速度、反轉錄時間等反應條件的優化，以及特異性、敏感性和重復性試驗，建立了基于ddPCR技術的H7亞型AIV的檢測方法，為H7亞型AIV的早期、快速、定量檢測提供了新的技術手段，為H7亞型AIV的防控提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 病毒 經β-丙內酯滅活的H7N9、H5N6、H9N2亞型AIV、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒，均由中國動物衛生與流行病學中心保存。

1.2 主要儀器與試劑 數字PCR儀一體機(DQ24 Pro)，購自蘇州思納福醫療科技有限公司；熒光定量PCR儀(QuantStudio 5)，購自美國賽默飛公司。RNA提取試劑盒，購自濟凡生物科技(蘇州)有限公司；一步法RT-PCR試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；pMD18-T載體，購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；數字PCR試劑和耗材，均購自蘇州思納福醫療科技有限公司。

1.3 引物和探針 根據GenBank和GISAID公開的H7亞型AIV的血凝素(Hemagglutinin，HA)基因序列，設計引物和探針。上游引物H7-F：CTA ATT GAT GGT TGG TAT GGT TTC，下游引物H7-R：AAT TGC CGA TTG AGT GCT TTT，探針H7-P：FAM-CAG AAT GCA CAG GGA GAG GGA ACT GCT-BQH1。引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 重組質粒標準品的構建與鑒定 按照RNA提取試劑盒說明書提取H7N9病毒RNA，作為模板，采用一步法RT-PCR試劑盒，以上、下游引物(H7-F和H7-R)擴增HA基因片段，擴增產物預期大小為87 bp；使用膠回收試劑盒回收PCR產物，然后連接至pMD18-T載體，構建重組質粒pMD18-H7，通過BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切進行鑒定。使用分光光度計測定質粒標準品濃度后按照公式(1)計算標準品拷貝數。

Copies/μL=6.02×1023×dsDNA質量濃度(ng/μL)×10-9÷相對分子質量(g/mol)

(1)

1.5 ddPCR反應條件優化

1.5.1 引物和探針濃度的優化 設置ddPCR反應體系(20.0 μL)：One-step ddPCR supermix 5.0 μL，Reverse transcriptase 2.0 μL，300 mmol/L DTT 1.0 μL，模板(H7N9亞型AIV核酸)2.0 μL；引物和探針組成設置3個組合，分別為600和150 nmol/L、900和250 nmol/L、1 200和350 nmol/L；用水補齊至20.0 μL。PCR擴增程序：50 ℃ 20 min；95 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，40個循環；98 ℃ 10 min；12 ℃ 60 min；升降溫速率設置為2.0 ℃/s。

1.5.2 退火溫度的優化 根據1.5.1引物和探針濃度的優化結果配制反應體系。PCR擴增程序設置4個不同退火溫度：50 ℃、53 ℃、55 ℃、58 ℃，其他程序同1.5.1。

1.5.3 升降溫速度的優化 根據1.5.1引物和探針濃度的優化結果配制反應體系。PCR擴增程序采用1.5.2優化好的退火溫度，設置3個升降溫速度：1.0 ℃/s、2.0 ℃/s、3.0 ℃/s，其他程序同1.5.1。

1.5.4 反轉錄時間的優化 根據1.5.1引物和探針濃度的優化結果配制反應體系。PCR擴增程序設置2個反轉錄時間：15 min和20 min，其他反應參數為優化后的反應條件。

1.6 標準曲線的建立 將1.4中制備好的重組質粒標準品稀釋至100、101、102、103和104copies/μL，利用優化后的反應條件進行ddPCR檢測，每個濃度設3個重復，以不同拷貝數的標準品為橫坐標，以ddPCR檢測的實際拷貝數為縱坐標，建立ddPCR標準曲線。

6月14日，全球高新技術工程和工業領域的重要領軍者法國登萊秀集團（Groupe?Delachaux）宣布已經于5月29日在武漢成立了新的工廠，以滿足亞洲市場不斷增長的需求和實現公司在亞太地區擴張的目標。截止2017年年末，亞太地區的銷售額已經占其總銷售額的29%。登萊秀集團武漢工廠占地面積14?000?m2，雇傭人數超過200人。該工廠生產登萊秀集團在鐵路基礎設施以及能源和數據管理系統設施領域的全系列產品，是登萊秀集團全球唯一在同一廠房內生產這兩種類型產品的工廠。該工廠是登萊秀集團在亞洲的旗艦，充分體現了集團的技術實力，以及在管理、環境和安全方面的最佳實踐。

1.7 特異性試驗 提取H7、H5、H9亞型AIV、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒RNA，反轉錄cDNA作為模板，用建立的ddPCR方法分別進行檢測，分析該方法的特異性。

1.8 重復性試驗 選取4個不同濃度的重組質粒標準品，分別進行批內重復性試驗和批間重復性試驗，每份樣本重復檢測8次，計算標準偏差和變異系數。

1.9 敏感性試驗 將1.4中制備好的重組質粒標準品進行10倍倍比稀釋(10-8～10-13)，利用優化后的ddPCR方法檢測敏感性。同時進行熒光定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)試驗，比較2種檢測方法的靈敏性。

1.10 臨床樣本的檢測 利用建立的ddPCR方法對60份臨床疑似H7亞型AIV感染樣品進行檢測。同時采用雞胚分離方法進行病毒分離，比較2種方法的符合率。

2 結果

2.1 重組質粒標準品的構建與鑒定 以H7N9亞型AIV RNA為模板，擴增得到HA基因片段，連接至pMD18-T載體，重組質粒經BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，電泳結果顯示，插入片段的大小與預期一致(圖1)，測序結果正確，重組質粒命名為pMD18-H7。使用分光光度計測定質粒標準品濃度，計算重組質粒標準品拷貝數為8×1011copies/μL。

圖1 重組質粒標準品pMD18-H7雙酶切鑒定

2.2 ddPCR反應條件優化 對引物和探針濃度、退火溫度和升降溫速率等條件進行優化，結果顯示，引物和探針反應濃度分別為900 nmol/L和250 nmol/L、退火溫度為55 ℃、升溫速率為2.0 ℃/s、反轉錄時間為20 min時，H7亞型AIV核酸樣品拷貝值最高，數值最穩定，為ddPCR最優反應條件(圖2)。

圖2 ddPCR反應條件優化

2.3 標準曲線的建立 將重組質粒標準品稀釋至100、101、102、103和104copies/μL，每個濃度進行3個重復檢測，建立標準曲線(圖3)，計算出相關系數R2=0.999 2>0.99，線性關系良好，表明該檢測方法可靠。

圖3 ddPCR方法標準曲線

2.4 特異性試驗 用建立的ddPCR方法分別對H7、H5、H9亞型AIV、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒進行檢測，結果顯示，H7亞型AIV檢測結果為862 copies/μL，其他病原均為0 copy/μL，表明該檢測方法特異性較好。

2.5 重復性試驗 重復性試驗結果顯示，組內重復性試驗和組間重復性試驗的變異系數(Coefficient of variation，CV)均小于3%(表1)，表明該方法具有良好的重復性。

表1 ddPCR重復性試驗

2.6 敏感性試驗 將制備好的重組質粒標準品進行10倍倍比稀釋(10-8～10-13)，利用優化后的ddPCR方法檢測，最低檢測下限為0.8 copies/μL，ddPCR方法敏感性比熒光定量PCR(qPCR)方法高10倍(表2)，表明建立的ddPCR方法敏感性較好。

表2 ddPCR與熒光定量PCR方法敏感性比較

2.7 臨床樣品的檢測 對臨床上疑似感染H7亞型AIV的60份樣品進行ddPCR檢測，12份檢測結果為陽性，48份為陰性，與雞胚分離方法結果一致，符合率為100%,表明建立的ddPCR方法可以對臨床樣品進行有效檢測，并可進行定量分析。

3 討論

2007年以來，H7N9亞型高致病性禽流感疫情時有發生，且病毒不斷變異，給養禽業造成了巨大經濟損失[16]。疫苗使用后，病毒的隱蔽性更強，導致病毒感染早期不易被發現，更準確和更靈敏的檢測手段是未來發展方向。數字PCR作為第3代PCR技術，具有更高靈敏度和直接絕對定量的優勢。數字PCR作為新一代分子診斷手段，越來越多地被應用于病原檢測等領域[11,12]。目前，利用ddPCR技術對H7亞型AIV的研究和應用相對較少。

引物和探針濃度過低會導致拷貝數降低，濃度過高則會抑制PCR反應。退火溫度過低會影響引物和探針與模板的結合效率，溫度過高會影響微滴的擴增效率。升降溫速度過快會影響微滴的穩定性，也會影響數字PCR擴增效率，升降溫速度過快或過慢均會影響試驗效果，導致陽性微滴散亂。本研究針對H7亞型AIVHA基因序列設計特異性引物和探針，并進行了最佳引物探針濃度、最佳退火溫度、最佳升降溫速度、反轉錄時間等反應條件的摸索，建立了H7亞型AIV ddPCR檢測方法，并進行了特異性、敏感性和重復性試驗。結果顯示，最佳引物濃度和探針濃度分別為900 nmol/L和250 nmol/L，最佳的退火溫度為55 ℃，最佳升降溫速度為2.0 ℃/s，最佳反轉錄時間為20 min。

特異性和重復性試驗結果顯示，建立的ddPCR方法具有良好的特異性，與其他常見禽病病毒不發生交叉反應，僅能檢測出H7亞型AIV，且重復性較好。該方法的檢測結果與重組質粒標準品拷貝數的相關系數為R2=0.999 2，表明該方法具有良好的線性關系和可信度。敏感性試驗結果顯示，建立的ddPCR方法最低檢測限度為0.8 copies/μL，敏感性比qPCR高10倍，具有較高的靈敏度，表明該方法在早期感染或潛伏感染檢測以及免疫效果評估中具有巨大的應用價值。

對60份臨床樣品的檢測結果顯示，建立的ddPCR方法可以對臨床樣品中的病毒含量進行絕對定量，并與雞胚分離方法結果一致。因此，本研究建立的ddPCR方法特異性強、靈敏度高，能夠快速檢測到樣本中含量極低的H7亞型AIV，適用于H7亞型AIV的痕量檢測、流行病學調查、診斷方法評估、標準物質研制、免疫效果評估，為H7亞型AIV的科學防控和研究提供了有力的技術儲備。