中國大鯢出血癥發病原因及致病菌基因組分析

趙彥華，張世勇，劉洪巖，孫夢玲，薛 暉

(江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017)

中國大鯢(Andriasdavidianus)在分類學上屬于兩棲綱(Amphibia)、有尾目(Caudata)、隱鰓鯢科(Cryptobrachidae)、大鯢屬(Andrias)，因其叫聲似嬰兒啼哭，民間俗稱“娃娃魚”，是我國現存最大的兩棲動物[1]。自1978年我國首次人工繁育中國大鯢以來[2]，全國各地陸續開展了中國大鯢的人工繁育和養殖技術的研究，促進了中國大鯢養殖業的快速發展[3]。但隨著養殖規模的擴大、種質的退化和養殖環境的惡化，越來越多的疾病給大鯢養殖業造成了嚴重的經濟損失。近幾年，在江蘇省中國大鯢養殖廠出現一種以表皮出血為主并伴有部分皮膚潰爛的疾病，引起該病的病原尚未確認，臨床治療上存在很大的障礙，因此本試驗通過對發病的中國大鯢開展致病原因探究和致病菌的全基因組分析，從而為臨床病害防控提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 75%消毒酒精，購自青島海氏海諾英諾消毒科技有限公司；腦心浸出液肉湯(Brain heart infusion,BHI)平板、營養瓊脂(Nutrient agar,NA)平板、血瓊脂(Blood agar,BA)平板和革蘭染色液，均購自廣東環凱生物科技有限公司；細菌藥敏試劑片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；微量生化發酵管，購自北京陸橋生物技術有限公司；Taq酶、PCR Buffer、DL3 000 DNA Marker和Ezup柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器 基因擴增儀StepOnePlusTMReal-Time PCR System(5020)：德國賽默飛；顯微鏡(CX23)：日本奧林巴斯；分子凝膠成像分析系統(ChemiDoc XRS)：美國伯樂；生化培養箱(DHP-9162)、恒溫振蕩器(THZ-98A)：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 材料采集 患病中國大鯢，來自江蘇省湯山某大鯢養殖場，平均體長約55 cm，平均體重約1 800 g。健康中國大鯢，來自江蘇省鎮江市某大鯢養殖場，共30尾，平均體長約8 cm，平均體重約48 g。

1.4 發病原因初步鑒定

1.4.1 患病大鯢臨床癥狀和剖檢觀察 選取癥狀明顯患病大鯢，觀察臨床特征，體表是否存在贅生物，隨后進行體表消毒，嚴格按照無菌操作流程打開腹腔，觀察腹腔內臟器情況。

1.4.2 病毒感染鑒定 取患病大鯢潰爛處皮膚肌肉、肝臟和腸道組織，加入無菌生理鹽水進行研磨，研磨液利用無菌針式過濾器(0.22 μm)進行過濾，將過濾后濾液無菌注射于健康大鯢背部肌肉，共注射4尾，每尾2 mL，暫養于水族箱中觀察14 d。

1.4.3 病原菌分離和鏡檢 無菌接種環輕壓發病大鯢肝臟橫截面和腸道內壁，劃線接種于NA平板，置于28 ℃恒溫培養箱，培養48 h后挑取典型菌落進行純培養，純培養后細菌接種于BA平板，觀察細菌溶血性；選用革蘭染色法對純培養后細菌進行染色，鏡檢觀察細菌形態和染色特征。

1.5 人工感染試驗 將健康大鯢于水族箱中適應飼養7 d，水族箱規格為1 100 cm×500 cm×700 cm，水溫控制為22 ℃，試驗共設置2個試驗組和1個對照組，每組4尾。將健康大鯢體表皮膚無菌劃傷，在試驗組水族箱中加入15 mL含病原菌肉湯培養基，對照組大鯢則放入15 mL無菌肉湯培養基，連續觀察14 d，記錄各組大鯢感染數。取發病大鯢肝臟和腸道組織進行病原菌的分離和鑒定。

1.6 病原菌生化鑒定 將病原菌接種于微量生化發酵管，以微量發酵管的形式進行生化指標檢測。

1.7 16S rDNA序列的擴增和分析

1.7.1 DNA提取和PCR擴增 按照Ezup柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒說明書提取病原菌DNA，并測定其濃度和純度。以提取的DNA為模板，選用細菌16S rDNA通用引物進行聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)擴增，PCR反應體系(25.0 μL)：10×PCR緩沖液(含Mg2+)2.5 μL、10 mmo/L 4×dNTP 1 μL、10 μmol/L正向和反向引物各0.5 μL、TaqDNA聚合酶(5 U)0.2 μL、DNA模板0.5 μL，加入ddH2O至25.0 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性25 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環30次；72 ℃延伸10 min。委托生工生物工程(上海)股份有限公司對擴增產物進行純化和測序。

1.7.2 序列分析和系統發育樹構建 測序后，在GenBank數據庫中輸入測得的病原菌16S rDNA 序列并進行BLAST比對。將病原菌16S rDNA序列通過美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的BLAST檢索系統進行序列同源性分析，檢索出高同源性的序列使用MEGA 4.0軟件，采用鄰接法(Neighbor-joining method)構建系統發育樹，并進行置信度檢測。

1.8 藥敏試驗 選取9種常用抗菌藥，按照紙片擴散法進行試驗，將濃度為1×107CFU/mL的病原菌懸液均勻涂布于BHI平板培養基上，加入藥敏試紙片，每種藥敏試紙片設立2個試驗組和2個對照組，28 ℃培養24 h后測量抑菌圈直徑，計算2個試驗組抑菌圈直徑平均值作為結果進行判定，直徑≥16 mm判定為敏感(Sensitivity,S)，直徑介于11～15 mm判定為中介(Intermediary,I)，直徑≤10 mm判定為耐藥(Resistance,R)。

1.9 全基因組分析 利用Illumia測序方法，對病原菌基因組進行測序，獲得原始圖像數據，經Base Calling轉化為序列數據進行基因組組裝和測序，進行基因功能注釋和預測。利用Trimmomatic軟件對原始測序數據進行質量剪切，得到測序數據，最后經過Nanopore三代測序，利用RNAmmer-1.2和tRNAscan-SE 2.0.4軟件對基因組中包含的核糖體RNA(Ribosomal RNA,rRNA)和轉運RNA(Transfer RNA,tRNA)進行預測，采用R circlize包進行基因組圈圖繪制，全面展示基因組的特征。

2 結果

2.1 患病大鯢臨床癥狀和剖檢觀察 患病大鯢主要臨床癥狀為體表有大量彌散性出血點，頭部皮膚較為嚴重并伴有潰爛，行動遲緩，拒絕進食，剖檢后發現其腹腔內肝臟有大量出血點，腸壁充血，脾臟發白。

2.2 病毒感染鑒定 無菌組織勻漿注射于健康大鯢后連續觀察14 d，大鯢活動和進食正常，無肉眼可見病害癥狀出現，排除病毒感染可能性。

2.3 病原菌分離和鏡檢 從患病大鯢肝臟中分離出1株優勢菌株，命名為WG-1。分離菌在營養瓊脂平板上呈現出表面光滑、邊緣整齊、圓形微凸的乳白色菌落，不溶血(圖1)。革蘭染色后在顯微鏡下可見紅色呈短鏈分布的球桿狀細菌，無鞭毛和莢膜，為革蘭陰性菌。

圖1 病原菌在營養瓊脂平板(A)和血平板培養基(B)上生長狀態

2.4 人工感染試驗 人工感染病原菌后，試驗組大鯢于試驗第8天首次出現感染癥狀，至第14天試驗結束時，2個試驗組感染率分別為100%和75%，臨床癥狀與中國大鯢出血癥癥狀相似，體表有出血點，頭部潰爛，行動遲緩，對照組大鯢無癥狀。在2個試驗組發病大鯢肝臟和腸道組織中均分離出與病原菌WG-1形態一致的細菌，符合科赫氏法則要求。

2.5 病原菌生化鑒定 生化試驗結果顯示，病原菌氧化酶試驗陰性、V-P試驗陰性、吲哚陽性、鳥氨酸脫羧，可分解葡萄糖，不可分解甘露醇、七葉苷、阿拉伯糖和蔗糖。

2.6 PCR擴增、序列分析和系統發育樹構建 病原菌16S rDNA擴增后得到1 474 bp的片段(圖2)。同源序列的BLAST結果顯示，病原菌與AR0057(GenBank登錄號:CP027177.1)摩根氏菌屬(Morganella)細菌的同源性達99.93%，與分離病原菌相似度最高的8個菌株均同屬于摩根氏菌屬，表明分離病原菌屬于摩根氏菌屬。系統發育分析結果顯示，病原菌在系統發育樹上與分離自海產品的摩氏摩根菌(MorganellamorganiiNR_115750.1)聚為一支(圖3)。

圖2 WG-1 16S rDNA基因的PCR擴增

圖3 基于16S rDNA基因序列構建的系統發育樹

2.7 藥敏試驗 選擇氨曲南等9種抗菌藥進行藥敏試驗，結果顯示，病原菌對卡那霉素最敏感，鏈霉素次之，對羧芐西林、多黏菌素和呋喃妥因有耐藥性(表1)。

表1 耐藥性分析結果

2.8 全基因組分析

2.8.1 基因組組裝與預測 分離病原菌測序結果見表2，基因組有效數據量為2 350.4 Mb，Reads個數為2 790 545個，平均測序讀長為1 547 bp，N50長度為2 872 bp。運用ABySS軟件對數據進行組裝，并運用GapCloser軟件對組裝結果進行校正，組裝結果統計見表3，組裝后基因組總長度為3 824 333 bp，G+C含量為51.05%。利用Glimmer 3.02軟件對該基因組進行基因預測，預測結果見表4，共得到3 732個編碼蛋白的基因，基因總長度為3 342 762 bp，基因平均長度為895 kb，基因的G+C含量為52.4%。

表2 測序數據統計

表3 組裝結果統計

表4 基因預測結果統計

2.8.2 非編碼RNA統計 結果如表5所示，分離病原菌基因組含有82個tRNA，總長度為6 439 bp，占基因總長度的0.16%；含有22個rRNA,總長度為31 986 bp，占基因總長度的0.83%，其中包括：8個5S rRNA，總長度為920 bp，占基因總長度的0.02%；7個16S rRNA，總長度為10 717 bp，占基因總長度的0.28%；7個23S rRNA，總長度為20 349 bp，占基因總長度的0.53%。

表5 非編碼RNA統計

2.8.3 基因功能注釋 將預測基因的蛋白序列分別與NR、GO、eggNOG、KEGG、Swiss-Prot、CAZy、CARD數據庫進行比對，基因功能分析結果顯示，分別有3 664、1 780、2 961、2 328、2 716、66和96個基因在對應的NR、GO、eggNOG、KEGG、Swiss-Prot、CAZy和CARD數據庫獲得注釋。

表6 基因功能注釋統計

2.8.4 基因組圈圖 結果如圖4所示，圈圖的最外圈、第2圈、第3圈分別為基因組大小的標識、正鏈上編碼蛋白序列、負鏈上編碼蛋白序列，顏色的不同表示編碼序列不同的同源性功能分類；第4圈為rRNA和tRNA；第5圈為G+C含量，該區域G+C含量如高于全基因組平均G+C含量，則用向外的紅色顯示，峰值的高低與平均G+C含量差值呈正相關；如該區域G+C含量低于全基因組平均G+C含量，則用向內的藍色表示，峰值的高低與平均G+C含量差值呈正相關；最內圈為G+C skew值，計算公式為G-C/G+C，在生物學意義上，如該值為正值時，正鏈更傾向于轉錄編碼序列；為負值時，負鏈更傾向于轉錄編碼序列。

圖4 基因組圈圖

3 討論

目前，據研究報道已發現中國大鯢病害有10多種[4]，其中臨床上較常見的病害為細菌病，感染中國大鯢的細菌多種多樣，包括遲鈍愛德華菌(Edwardsiellatarda)[5]、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[6]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[7，8]、溫和氣單胞菌(A.sobria)[9]和殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種(A.salmonicidasubsp．salmoni-cida)[10]等。1999年，王高學等首次發現了熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)感染可導致大鯢患赤皮病，該菌株對鏈霉素、氯霉素、氟哌酸和慶大霉素高度敏感，臨床選用硫酸慶大霉素肌內注射，治療效果較好[11]；2010年，王旭等發現元兇維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)感染可導致大鯢腐皮病，藥敏試驗顯示該菌對頭孢類抗菌藥較敏感[12]；2011年，杜宗君等通過對四川人工養殖死亡的大鯢研究發現，熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)感染可導致大鯢花斑肝，致病菌對新生霉素、氯霉素和強力霉素較為敏感，推薦采用敏感藥物內服或肌內注射進行治療[13]；2012年，高正勇等研究發現，弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)可感染大鯢造成死亡，藥物敏感性試驗顯示，該菌株對氨曲南、頭孢三嗪、先鋒噻肟等9種藥物高度敏感，建議根據藥敏試驗選擇最有效的藥物進行治療[14]。

摩氏摩根菌(Morganellamorganii)是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)摩根氏菌屬(Morganella)的唯一菌種，目前分為2個亞種：摩根亞種和波斯尼亞種[15]。摩氏摩根菌為條件致病菌，能夠造成動物肺臟淤血、膿腫，腎臟出血等病變，也可以造成動物體表皮膚或肌肉的潰爛[16]。

本次試驗根據分離病原菌藥物敏感性試驗結果，臨床上建議首選卡那霉素進行治療；同時有文獻報道，我國1990年已從進口冷凍海魚中分離出摩根氏菌[17]，結合本試驗所得病原菌在系統進化樹上與海鮮中分離到的摩氏摩根菌聚為一支這一特點，建議在大鯢日常養殖中關注投喂的海鮮產品的質量，以防造成細菌性疾病大暴發。