miR-142-5p對LPS誘導的小鼠乳腺上皮細胞炎性因子釋放和增殖、凋亡的影響

盧勁曄，顧蓓蓓，法艷梅，劉 靜，何祥來

[1. 江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300 ； 2. 泰州海關綜合技術服務中心，江蘇 泰州 225300 ；3. 青島西海岸新區(黃島區)農業農村局，山東 青島 266427]

乳腺炎是困擾奶牛養殖業并造成嚴重經濟損失的重要疾病之一。乳腺炎的防治效果不僅關系到奶牛養殖業的經濟效益，更為重要的是與公眾食品安全和人類健康密切相關[1]。大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)是臨床上引起奶牛乳腺感染最重要的病原菌之一，也是環境性乳腺炎病原菌的代表。抗菌藥頻繁使用致使耐藥菌株的不斷產生，增加了臨床上乳腺炎防治的難度[2,3]。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是大腸埃希菌細胞膜的主要元件，通過Toll樣受體4(Toll-like receptors 4，TLR4)促進細胞內信號轉導，激活核因子κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)，增加炎性細胞因子的分泌，進一步促進乳腺炎的發展[4-6]。有趣的是，作為乳腺組織的主要功能細胞，乳腺上皮細胞不僅在乳汁的合成和分泌中起著重要作用，還是一種重要的病原體屏障[7，8]。因此，探討乳腺上皮細胞的自身防御機制對預防炎癥具有重要意義。

微RNA(microRNAs,miRNAs)是一類由21～23個堿基組成的單鏈小RNA分子，具有高度的保守性。miRNAs在轉錄后起重要作用，與靶基因特異性結合后通過降解或抑制mRNA調控靶基因的表達[9，10]。研究表明，miRNA通過調節細胞的增殖、凋亡和免疫防御反應在動物抵御乳腺感染中發揮了重要作用[11，12]。Wang等研究表明，牛miR-146a可通過靶向調節TRAF6基因增加乳腺上皮細胞炎癥因子的表達，提高乳腺上皮細胞的免疫應答水平[13]。Lai等研究發現，miR-92a可作為奶牛乳腺炎的標記分子[14]。Sun等研究表明，奶牛乳腺炎發生時miR-142-5p表達上調[15]。然而miRNA在乳腺炎發病機制中的研究尚處于起步階段，本試驗通過研究miR-142-5p對LPS引起的乳腺上皮細胞增殖、凋亡和免疫應答的影響，探討miR-142-5p對乳腺炎的影響，為臨床上研究奶牛乳腺炎的防治新策略提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清、DMEM培養基和TRIzol?Reagent，均購自美國英杰生命技術有限公司；小鼠miR-142-5p模擬物(Mimics)、抑制劑(Inhibitors)和相應的陰性對照小分子RNA，均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；細胞因子ELISA檢測試劑盒，購自武漢新啟迪生物科技有限公司；細胞凋亡試劑盒和EdU試劑盒，均購自上海碧云天生物技術有限公司；羊抗兔AKT、p-AKT、P65、p-P65、GAPDH和HRP標記山羊抗家兔IgG抗體，均購自艾博抗(上海)貿易有限公司；細胞核蛋白與總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒，均購自北京博邁德科技發展有限公司；ECL化學發光檢測試劑盒，購自安諾倫(北京)生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 UV755B型分光光度計，上海精密科學儀器有限公司產品；光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品；MIKRO-22R型高速冷凍離心機，德國赫提馳公司產品；垂直板電泳槽和半干轉印儀，美國伯樂公司產品；流式細胞儀，美國BD生物科學公司產品。

1.3 細胞來源 小鼠乳腺上皮細胞系(EpH4-Ev)，購自美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection,ATCC)。

1.4 試驗方法

1.4.1 細胞培養及處理 小鼠乳腺上皮細胞系置于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養基中，37 ℃、5%CO2條件下培養，每2～3 d換液。待細胞密度達90%后用0.25%胰蛋白酶進行細胞消化和傳代。取對數生長期的細胞，待細胞融合至80%～90%時，接種到6孔板中，完全貼壁后換液，將細胞分為6個組，分別是對照組(Control,CON)、脂多糖組(LPS)、脂多糖+抑制劑陰性對照組(LPS+inhibitors NC)、脂多糖+抑制劑組(LPS+inhibitors)、脂多糖+模擬物陰性對照組(LPS+mimics NC)和脂多糖+模擬物組(LPS+mimics)，每組設6個重復孔(n=6)，對應組別細胞中加入抑制劑或模擬物繼續培養48 h后，加入LPS(10 μg/mL)共培養2 h，收集樣品進行后續檢測。

1.4.2 ELISA檢測細胞因子表達 收集細胞上清液，采用ELISA方法檢測腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素6(Interleukin 6,IL-6)、白細胞介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)和白細胞介素8(Interleukin 8,IL-8)表達水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡 胰酶消化并收集細胞，PBS洗滌后，分別進行細胞周期和細胞凋亡的檢測。細胞周期檢測：收集的細胞于預冷的70%乙醇中4 ℃固定4 h，離心重懸細胞，用RNase A和PI溶液對細胞進行染色，混勻，室溫下避光孵育30 min，利用細胞內DNA能與PI結合的特性，通過流式細胞儀檢測細胞各個時期的DNA含量，重復3次。細胞凋亡檢測：細胞加入Annexin V-FITC混勻，室溫下避光孵育15 min，上機前5 min再加入PI溶液，1 h內流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.4.4 EdU法檢測細胞增殖活力 具體操作按照試劑盒說明書進行。細胞接種于24孔板，每孔加入10 μmol/L EdU溶液，37 ℃孵育4 h后去除培養液，PBS洗滌。4%多聚甲醛室溫固定15 min，清洗，0.3% TritonX-100通透15 min，按照試劑盒說明書配置Click反應液，37 ℃避光孵育30 min。Hoechst避光復染細胞核5 min，熒光顯微鏡下觀察細胞增殖活力。

1.4.5 Western blot檢測蛋白表達 提取細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取20 μg總蛋白經12% SDS-PAGE電泳分離后轉印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入GAPDH、AKT、p-AKT、P56、p-P56一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃搖床中孵育過夜。次日TBST充分洗滌，經辣根過氧化物酶標記二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，充分洗滌，用ECL化學發光檢測試劑盒顯色。以GAPDH 為內參，經凝膠圖像分析系統對條帶進行光密度測定并分析，以目的蛋白和內參條帶的光密度比值代表相應蛋白的相對表達水平。試驗重復3次，取平均值。

1.5 數據分析 數據以“平均數±標準差(Mean±SD)”表示，采用SPSS 19.0中ANOVA程序對試驗結果進行方差分析和Duncan氏多重比較，以P<0.05(差異顯著)作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 miR-142-5p對細胞因子表達的影響 與對照組比較，LPS組TNF-α(圖1A)、IL-6(圖1B)、IL-1β(圖1C)、IL-8(圖1D)的分泌水平均顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+inhibitors組顯著抑制LPS誘導的上述上調作用(P<0.05)，LPS+mimics組上述上調作用進一步增強(P<0.05)，LPS+inhibitors NC組和LPS+mimics NC組差異均不顯著(P>0.05)。

圖1 乳腺上皮細胞炎性因子的變化

2.2 miR-142-5p對AKT和P65蛋白磷酸化水平的影響 如圖2所示，與對照組比較，LPS組p-AKT和p-P65蛋白相對表達水平顯著上調(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+inhibitors組上述上調作用被顯著抑制(P<0.05)，而LPS+mimics組上調作用顯著增強(P<0.05),LPS+inhibitors NC組和LPS+mimics NC組則差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 乳腺上皮細胞AKT、P65及其磷酸化水平的變化

2.3 miR-142-5p對小鼠乳腺上皮細胞細胞周期和細胞增殖的影響 與對照組相比(圖3A)，LPS組G0/G1期細胞比率上升(圖3B)，LPS+mimics組G0/G1期細胞比率進一步上升(圖3F)。同時，與對照組相比，LPS組S期細胞比率下降(圖3B)，LPS+mimics組下降更明顯(圖3F)。細胞增殖檢測結果顯示，與對照組相比(圖4A)，LPS組乳腺上皮細胞的增殖活力受到抑制(圖4B)；與LPS組相比，LPS+mimics組抑制效果更明顯(圖4F)。說明miR-142-5p過表達可抑制細胞S期DNA合成過程，導致乳腺上皮細胞周期被阻滯在G0/G1期，抑制細胞增殖。

圖3 miR-142-5p對乳腺上皮細胞細胞周期的影響

圖4 miR-142-5p對乳腺上皮細胞細胞增殖活力的影響

2.4 miR-142-5p對小鼠乳腺上皮細胞細胞凋亡的影響 為驗證miR-142-5p在調節LPS誘導的乳腺上皮細胞凋亡進程中的作用，本試驗檢測了細胞凋亡率。如圖5所示，與對照組相比，LPS組乳腺上皮細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+inhibitors組細胞凋亡率顯著下調(P<0.05)，LPS+mimics組細胞凋亡率進一步升高(P<0.05)，LPS+inhibitors NC組和LPS+mimics NC組差異均不顯著(P>0.05)。說明miR-142-5p在LPS誘導的乳腺上皮細胞的凋亡中起促進作用。

3 討論

miRNAs是一類內源性的，長度為18～24個核苷酸的小RNA，廣泛存在于動植物體內，具有高度的保守性。miRNAs參與細胞增殖、分化、凋亡等多種生命活動，在疾病的發病機制中發揮了重要的作用。研究證實，炎癥刺激后miR-142在骨骼、肺等器官中均有表達，其在炎癥的發生與發展過程中具有重要的調節作用[16,17]。急性肺損傷小鼠支氣管肺泡灌洗液和外周血中miR-142的表達均顯著增加，LPS誘導的急性腎損傷大鼠系膜細胞中miR-142-3p的表達亦上調[18]。關節炎患者關節滑液中miR-142的表達水平與炎癥持續的時間相關，提示其參與了炎癥預后，與滑膜組織的增生和修復密切相關[19]。本試驗結果顯示，經LPS處理的乳腺上皮細胞中miR-142-5p的表達上調，且miR-142-5p 模擬物能促進NF-κB通路的激活，并進一步上調LPS誘導的細胞因子的表達，該結果與Sun等的研究結果一致[20]，表明miR-142-5p可能在乳腺炎中起到促炎作用。

本試驗進一步研究了LPS和miR-142-5p對小鼠乳腺上皮細胞增殖和凋亡的影響。結果顯示，LPS處理后細胞阻滯于G0/G1期，經miR-142-5p模擬物處理后細胞周期的阻滯效果顯著提高，miR-142-5p模擬物抑制劑處理對阻滯效果則有所緩解，表明miR-142-5p能抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，而凋亡的上皮細胞降解會誘導有毒物質和促炎性物質的分泌。

本試驗也存在一些局限性，1個miRNA可能有多個靶點，1個基因可能有多個miRNAs靶點，因此本結果有待在體內進一步證實。體外試驗結果表明，miR-142-5p可能通過調節炎性因子的釋放分泌以及細胞的增殖和凋亡在乳腺炎中發揮促炎作用，該結果為臨床上乳腺炎的防治提供了一種新的思路。