青島地區3株犬細小病毒全基因組分析

原昆鵬，曲雪婷，孫軍昌，王 旭, 齊昊南，陳淑貞，王冬冬，尹 月 ，臧立鈺，衣玉穎，劉均華，尹燕博，溫建新

(1.青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109 ； 2.青島市即墨區畜牧業發展服務中心，山東 青島 266225 ；3.青島博隆實驗動物有限公司，山東 青島 266225 ； 4.青島市農業行政執法支隊，山東 青島 266071)

犬細小病毒病是幼犬最危險的傳染病之一，受感染犬臨床特征是嘔吐、發燒、腹瀉、出血性腸炎、心肌炎和白細胞減少癥[1]。犬細小病毒病是由犬細小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的，CPV屬于細小病毒科，細小病毒屬，是一種無囊膜單股負鏈DNA病毒[2]。CPV全長約5.3 kb，包括2個主要的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，1個編碼結構蛋白VP1和VP2，另1個編碼非結構蛋白NS1和NS2[3]。

CPV于1978年首次被發現，為了與犬微小病毒(Minute virus of canine，MVC)區分被命名為CPV-2[4]。1979—1981年發現抗原變異株CPV-2a[5]，1984年變異株CPV-2b被發現[6]。抗原變異株CPV-2c于2000年首次報道[7]。在我國，CPV-2感染于1982年首次被報道[8]，CPV-2a于1986年被報道[9]，CPV-2b出現于1997年[10]，CPV-2c于2010年在吉林省被發現[11]。近年來，new CPV-2a和new CPV-2b開始在中國流行[12]。目前，new CPV-2a和new CPV-2b似乎已經取代了CPV-2a和CPV-2b的原型株，并已成為許多國家的主要流行型[9]。

CPV-2在抗原多樣性方面持續增加，其進化速度接近每年每個位點10-4個替代[13]。目前，我國寵物臨床CPV防疫多使用進口疫苗，這些進口疫苗均源于原始的CPV-2毒株[14]。本研究從2012—2020年青島地區使用進口疫苗免疫過的臨床CPV發病犬中，先后分離到3株CPV，全基因組序列分析發現，與傳統的CPV-2毒株相比，分離毒株已發生較大變異，這可能是導致CPV臨床免疫失敗的主要原因。

1 材料與方法

1.1 病料采集 青島市使用進口CPV疫苗免疫過的，臨床癥狀為嘔吐、血樣腹瀉的發病犬，采集新鮮腸道組織作為分離病毒所用病料，低溫凍存。采集青島市使用進口CPV疫苗免疫過的成年健康犬糞便為健康犬對照樣品。

1.2 主要試劑 DMEM培養基、胎牛血清，均購自Cytiva公司；病毒DNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、DL-2 000 DNA Marker、DL-5 000 DNA Marker、pMD18-T載體(pMDTM18-T Vector Cloning Kit)、DH5α感受態細胞、PrimeStar HS DNA聚合酶，均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 PCR基因擴增儀[TC-96/G/H(b)型]，杭州博日公司產品；電泳儀(JY600E型)、核酸電泳槽(JY-SPFT型)、凝膠成像儀(JY04S-3C型)，君意東方公司產品。

1.4 樣品處理 將病料與無菌PBS(pH=7.2)按照1∶5比例混合研磨，反復凍融3次后8 000 r/min 高速離心10 min，取上清用0.22 μm濾器過濾除菌，-80 ℃保存。

1.5 病毒分離 采用同步接毒的方式，向傳代后的F81 細胞懸液按1∶9(體積比)接入經處理后的樣品，置于37 ℃、5% CO2培養箱中，次日用含1%血清的細胞維持液進行換液。每天觀察細胞病變(Cytopathic effect,CPE)情況，傳至出現較穩定的 CPE 后收毒，同時設正常 F81 細胞為陰性對照。

1.6 PCR鑒定 按照本實驗室建立的犬細小病毒 PCR 診斷檢測方法[15]對健康犬對照樣品、第3代F81細胞培養物進行PCR鑒定，同時設立陽性對照(本實驗室保存的CPV分離株)和陰性對照(未接種樣品的F81細胞培養物)。通過病毒DNA提取試劑盒提取DNA，以提取后DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系(25.0 μL)：2×Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，模板 2.0 μL，上游引物 1.0 μL，下游引物 1.0 μL。PCR反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35個循環；72 ℃，10 min。PCR產物4 ℃保存，取PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下觀察結果。

1.7 病毒全基因組分析

1.7.1 全基因組擴增 參照參考文獻[3,16]擴增病毒的全基因組，方法同1.6，并將本實驗室于2012年和2015年分離到的2株病毒(CPV-QD12和CPV-QD15)一同擴增。擴增的DNA產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。陽性PCR產物利用膠回收試劑盒進行膠回收純化后克隆至pMD18-T載體，連接體系：膠回收產物4 μL，SolutionⅠ5 μL，Vector 1 μL，混勻后16 ℃連接過夜。次日將連接產物轉化到DH5α感受態細胞中，涂板后挑取單菌落，擴大培養后進行菌液PCR鑒定，陽性菌液送青島睿博生物科技有限公司測序。

1.7.2 全基因組及VP2、NS1序列分析與系統進化樹構建 利用DNASTAR進行序列拼接，得到病毒全基因組序列。利用MegAlign軟件對本研究獲得的序列與參考株序列進行同源性分析。通過與GenBank中近幾年發表的其他CPV序列進行比較，進行全基因組及VP2、NS1核苷酸、氨基酸比對分析，并進行基因分型與氨基酸非同義替代分析。利用MEGA 7鄰接法構建系統進化樹。

2 結果

2.1 病毒分離 樣品同步接種F81細胞，盲傳到第3代開始出現典型的CPE，表現為接毒細胞脫落、變形、大范圍的拉網狀病變，陰性對照正常F81細胞生長良好，排列緊密，形狀統一(圖1)。將本研究于2020年分離到的CPV命名為CPV-QD20株。

圖1 光學顯微鏡下細胞形態(40×)

2.2 PCR鑒定 PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分離毒株的細胞培養物和陽性對照均與預期相符，在481 bp處出現明亮條帶；細胞陰性對照培養物PCR擴增結果為陰性(圖2)。

圖2 PCR擴增鑒定

2.3 病毒全基因組擴增 通過PCR對CPV全基因組進行擴增，結果顯示，在712、2 105、1 728、1 591、635、66和100 bp處出現與預期相符的7個條帶(圖3)。

圖3 全基因組的PCR擴增

2.4 序列分析 序列分析發現，分離獲得的3株CPV的基因組全長為5 055～5 062 bp。3株CPV全基因核苷酸同源性為99.0%～99.8%。NS1基因核苷酸同源性為99.1%～99.3%，氨基酸同源性為99.0%～99.4%。VP2基因核苷酸同源性為99.3%～99.9%，氨基酸同源性為99.7%～100%。3株CPV與參考毒株全基因核苷酸同源性為90.9%～99.8%。

2.5 系統進化樹構建 基于全基因組構建的系統進化樹顯示，CPV-QD12株與中國分離株MH476593、MF805798、MF805794親緣關系較近，其中親緣關系最近的是MH476593，核苷酸同源性為99.7%；CPV-QD15株與2017年中國分離株MH476590親緣關系最近，核苷酸同源性為99.9%。CPV-QD20株與MG013488、MH476592、MH476584、MH476583、MH476587處在同一分支，與2017年上海分離株CPV-SH1516核苷酸同源性最高，為99.8%(圖4)。

圖4 基于犬細小病毒全基因組的系統進化樹

2.6VP2、NS1蛋白氨基酸非同義替代分析 對3株CPV分離株編碼VP2蛋白、NS1蛋白的氨基酸序列與參考序列進行對比,氨基酸非同義替代結果如表1和表2所示。根據CPV基因分型的相關報道[17]，CPV-QD12和CPV-QD15為new CPV-2a型，CPV-QD20為CPV-2c型，健康犬對照樣品檢出CPV-2c型。

表1 VP2蛋白中非同義替代的氨基酸

續表

表2 NS1蛋白中非同義替代的氨基酸

3 討論

CPV-2的感染在世界各地非常普遍，本研究進行全基因組測序的3株CPV的基因型分別為new CPV-2a、CPV-2c。CPV-2a、CPV-2b、new CPV-2a、new CPV-2b和CPV-2c在我國均為流行株[9]。近年來，new CPV-2a成為我國部分地區的主要流行型，CPV-2c除了在我國流行之外，還是意大利、德國、烏拉圭、阿根廷、尼日利亞等國家的主要抗原變異型[18]。全基因組系統進化樹結果顯示，3株CPV與國外CPV分離株親緣關系較遠，與國內參考毒株同源性較高，都處在同一大分支中并沒有形成明顯獨立分支，這說明在青島地區分離的3株CPV與國內其他CPV流行株均源自同一祖先。但是，本研究全基因組測序的3株CPV的基因型，CPV-QD12和CPV-QD15為new CPV-2a型，CPV-QD20為CPV-2c型，健康犬對照樣品也檢出CPV-2c型，均與原始的CPV-2存在差異。本研究分離的CPV-QD20為CPV-2c型，說明青島地區CPV毒株出現了新的基因型，不排除new CPV-2a型和CPV-2c型同時流行的可能。

VP2蛋白是CPV-2的主要結構蛋白，參與宿主免疫應答，VP2基因的突變可能改變CPV-2的類型、感染和致病性[19]。VP2基因的第5、87、267、300、322、323、324、334、341、370、440、555位氨基酸的突變已被證實與CPV-2的感染和致病性有關[3]。2014年以后的大部分CPV-2c分離株中VP2基因的第5位氨基酸都發生A→G突變，此處突變可能改變了CPV的抗原性和免疫原性[20]。本研究中3株CPV分離株都出現了第267位氨基酸F→Y突變，第324位氨基酸 Y→I突變。第267位氨基酸F→Y突變可能在傳播和感染中發揮重要作用[12]。第297位氨基酸S→A突變是new CPV-2a和new CPV-2b的標志[9]，本研究的2株new CPV-2a分離株均發生了該突變。第324位氨基酸 Y→I突變是近幾年來我國CPV分離株常見的氨基酸突變[21]。第370位氨基酸Q→R突變可能與宿主范圍的改變以及宿主紅細胞的血凝有關[20]。第426位的突變被用來區分CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c[3]。本研究中new CPV-2a 型CPV-QD12株和CPV-QD15株都在第440位出現氨基酸突變(T→A)，而CPV2c型CPV-QD20株則未出現此突變。

CPV的非結構蛋白NS1和NS2與病毒復制相關[22]。亞洲CPV-2c變異株在NS1基因的第60、544、545、630位氨基酸中都表現出特定的改變，這些氨基酸突變可能有助于進一步闡明CPV的進化情況[23]，對推斷CPV變異株的傳播是至關重要的[24]。關于CPV非結構基因的研究有限[13]，它們的作用需要進一步評估。

本研究中的3株CPV分離株均是從接種過疫苗的臨床發病犬中分離到的。在我國，CPV的商業疫苗株大多數是CPV-2型。接種CPV-2型疫苗可以對免疫動物形成交叉保護，使免疫動物抵抗強毒CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c的攻擊[25-27]。有報道顯示，近年來new CPV-2a成為我國部分地區的優勢變異株[28]，CPV-2型疫苗不能保護免疫犬抵抗new CPV-2a和new CPV-2b的攻擊[29]。本研究中的3株CPV分離株分屬new CPV-2a和CPV-2c兩個基因型，與原始CPV-2毒株存在差異。與其他CPV-2c型相比，本研究分離的CPV-20株在VP2基因和NS1基因中均出現了不同的氨基酸非同義替代。上述發現是否是CPV-2型疫苗免疫失敗的原因有待進一步試驗驗證。

CPV主要經糞口傳播，這是幼犬感染的重要原因。本研究從健康犬對照樣品中檢測到CPV-2c型病毒，說明使用進口CPV弱毒活疫苗的成年犬存在排毒問題?？梢?，將成年犬與幼犬隔離飼養是保護幼犬的重要措施。本研究認為應該使用CPV流行株研發滅活疫苗，做加強免疫，防止疫病擴散。CPV進化速度快，作為一種易變異的DNA病毒，在時間、空間和宿主方面對CPV進行持續的流行病學監測能夠及時掌握CPV變異情況，為疾病防控和疫苗株的更新提供參考。