UPLC-MS/MS測定桂皮中的氨基甲酸酯類農藥殘留

吳曉萍

福建中檢華日食品安全檢測有限公司（福州 350028）

桂皮（或肉桂、官桂或香桂）常被用作中藥、香料和調料。但近年來，隨著食品安全要求的提高和農藥的不合理使用，使得各個國家對這類產品制定嚴格的限量。農藥殘留問題影響我國桂皮的出口，故有必要建立一種能快速檢測桂皮中農藥殘留的方法。

關于桂皮中農藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜（GC）[1-3]和氣相色譜三重四極桿質譜聯用（GC-MS/MS）[4-5]。GC或GC-MS/MS對于檢測苯氨基甲酸酯類等沸點高且熱穩定性差的化合物并不適用，而液質聯用色譜對于這些化合物卻有著高于GC或GC-MS/M的選擇性和靈敏度[6]。桂皮一種相對基質較復雜中草藥，為提高檢測的準確性和避免對儀器造成污染，開發一種有效凈化前處理很有必要。農藥檢測常用的提取方法有固相萃取（SPE）[7]、基質固相分散萃取（MSPD）[8]、加速溶劑萃取法（ASE）[9]、液-液萃取（LLE）[10]和凝膠色譜法（GPC）[11]。其中，部分方法（如MSPD）需要大量有機溶劑（LLE）、特殊設備（GPC和ASE）和勞動量，所以環保型的檢測技術是目前主推的檢測手段[12]，如QuEChERS技術，其操作簡便，分析速度快，溶劑使用量少，污染小，近年來被廣泛用于復雜基質農藥的多殘留測定，但在對復雜基質凈化效果這方面還存在欠缺。因此，選擇一款高選擇性的凈化劑成為關鍵突破口，據報道，多壁碳納米管作為凈化劑被應用于農產品中農獸藥的檢測[13-15]，其吸附性能不僅優于C18、GCB和PSA等常用吸附材料，而且擁有高選擇性。故試驗采用改良后的前處理方法結合液相色譜串聯質譜技術，建立桂皮中氨基甲酸酯類的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPLC-MS/MS（Agilent 1290-6470，安捷倫有限公司）；低速離心機（德國Sigma公司）；克百威、3-羥基克百威、滅多威、涕滅威、涕滅威亞砜、涕滅威砜、甲萘威和異丙威（德國Dr. Ehrenstorfer公司）；PSA粉末（美國Supelco公司）；多壁碳納米管（上海麥克林生化科技有限公司）；多管渦旋混勻儀（逗點生物技術有限公司）；乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和乙酸銨均為分析純或色譜純（國藥科技）；試驗用水為三重過濾去離子水。

1.2 標準溶液的制備

標準儲備液：分別準確稱取一定質量的8種氨基甲酸酯類農藥標準品，用丙酮溶解、定容配制成不同濃度的標準儲備液，于-20 ℃的冰箱儲存。混合標準溶液：分別吸取不同體積的標準儲備液，用乙腈稀釋配制成10 mg/L的混合標準溶液，同樣置于-18 ℃儲存。

1.3 樣品的前處理

將樣品粉碎，準確稱取2.0 g（精確至0.01 g）于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL超純水渦旋30 s后浸泡30 min，加入15 mL乙腈、5.0 g氯化鈉混勻和漩渦振蕩3 min，在4 000 r/min條件下離心5 min，離心后取2.00 mL上清液于5 mL離心管（50 mg PSA、150 mg無水硫酸鎂和5.0 mg選擇性多壁碳納米管），漩渦振蕩2 min，在15 000 r/min條件下高速離心5 min，取上層清液過0.22 μm有機濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 色譜條件

色譜條件：ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國Agilent公司）；流動相A為0.1%甲酸乙酸銨水，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1.0 min，75% A；1～2.5 min，75%～70% A；2.5～4 min，10% A；4～5 min，10%～75% A，5～7 min，75%A；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量3 μL。

質譜條件：ESI源，正離子模式，毛細管電壓3.0 kV，離子源溫度300 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，錐孔反吹氣流量50 L/h，脫溶劑氣流量900 L/h，多反應監測模式（MRM）。

表1 8種農藥的保留時間、監測離子對、碰撞電壓（CE）和去簇電壓（DP）

2 結果與分析

2.1 檢測條件的優化

氨基甲酸酯類化合物是含有較強的電負性元素，如氧原子和氮原子等，在ESI+模式下，氨基甲酸酯類化合物中的這些強電負性元素可以和噴霧液滴中的H+形成加合離子（[M+H]+），從而實現檢測。一般進樣瓶和溶劑存在微量的鈉離子，這些鈉離子會和目標物形成較強的加合離子（[M+Na]+），從而降低基于[M+H]+的檢測靈敏度。但如果向流動相的水相中添加適量NH4+，便可有效抑制[M+Na]+的形成從而提高檢測[M+H]+的靈敏度[16]。通過MS2Scan選擇豐度最高的母離子，對去簇電壓進行優化，通過產物離子掃描選擇2個響應較大的子離子并對兩者的碰撞能量進行優化。響應值大的1組設為定量離子對，響應強度相對較弱的1組設為定性離子對。

為保證各農藥成分擁有足夠的靈敏度和較好的峰形，同時考察乙腈-水溶液（0.1%甲酸）、乙腈-含4 mmol/L乙酸銨的水溶液（0.1%甲酸）這2種流動相體系，得到如圖1所示的總離子流圖：選擇乙腈-含4 mmol/L乙酸銨的水溶液（0.1%甲酸）為流動相時，僅有部分農藥化合物（如涕滅威、滅多威）響應強度被抑制，大部分農藥化合物響應度高，峰形較好，故選擇加4 mmol/L乙酸銨的-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

圖1 8種化合物的總離子流圖

2.2 前處理條件優化

2.2.1 樣品加水量的考察

從含水量低的樣品中提取農藥時，用溶劑直接浸提難以充分滲透到組織內部，加入適量的水進行復水處理有利于提高目標農藥的回收率。試驗比較目標農藥分別加入5，10，15和20 mL水量后的回收率，結果表明，加水量5 mL時，6種農藥回收率＜70%；加水量10 mL時，8種農藥的回收率在70%～110%；加水量＞10 mL時，回收率＞110%的農藥數量明顯增多，且20 mL加水量的高回收率農藥數量較10 mL加水量的多。因此，2 g桂皮中加入10 mL水時，各個農藥化合物的提取效果最佳。

2.2.2 提取溶劑的選擇

為探究最佳提取方法，同時對乙腈、乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷4種提取溶劑進行考察，以8種農藥在桂皮上的平均回收率為評定依據。在樣品提取前加入10.0 mL超純水渦旋30 s，靜置30 min，提高樣品的分散程度，增大比表面積。結果表明，二氯甲烷和乙酸乙酯作為提取劑時，提取液顏色較深，提取出來的雜質較多；丙酮屬于易制毒溶劑且不易與水形成分層，對后續操作帶來較多不便；乙腈與水可互溶，水可以進入植物組織內部，兩者結合可以增加滲透性，從而明顯提高提取率。另外，乙腈可以適用極性范圍相對廣泛的農藥，加入氯化鈉可使得離子濃度增大且介電常數增大，可具有高離子溶劑的特征，有機物基本上沒有離子特征，兩者的溶解度進一步增大，可促進兩者快速分層，故提取溶劑選用乙腈。

2.2.3 凈化劑的選擇

傳統的QuEChERS吸附劑主要有PSA、GCB、C18和MgSO4，其中PSA是一種含有2個氨基的吸附劑，在不同的環境對不同的物質具有不同的吸附能力，故經常用于可除去樣品中的有機酸、脂肪酸和糖類等物質；GCB能去除色素、類胡蘿卜素、固醇，但是對具有平面結構目標物也有吸附，故很多文獻報道在提取劑中加入甲苯可以提高回收率，但甲苯是易制毒化合物且對人體傷害很大；然而MWCNTs（一種呈管狀結構新型的納米材料）的吸附特性一定程度上優于傳統的吸附劑，開展對其吸附性的探究試驗，固定PSA 50 mg、MgSO4150 mg用量條件下，考察不同MWCNTs用量（0，2，5，10和15 mg）對目標物回收率的影響，結果表明5 mg用量時目標物回收率最好。綜合考慮凈化效果與回收率，選擇5 mg多壁碳納米管作為吸附劑。

2.3 方法評價

2.3.1 方法的線性范圍、檢出限與定量限

在優化的試驗條件下，用桂皮空白樣品提取液將8種氨基甲酸酯類農藥標準溶液混合儲備液進行稀釋，配制成0.001～0.05 μg/mL的系列基質匹配標準溶液進行檢測、繪制標準曲線[橫坐標為8種農藥化合物的質量濃度（x，μg/mL），縱坐標為定量離子峰面積（y）]，以3倍信噪比計算8種農藥化合物在基質中的檢出限（SLOD），以最小添加濃度為定量限（SLOQ）。結果顯示，在0.001～0.05 μg/mL范圍內，8種農藥化合物的質量濃度與其峰面積間呈良好的線性關系，相關系數均＞0.99，8種氨基甲酸酯類的檢出限為0.003～0.007 mg/kg（詳見表2）。

表2 桂皮中8種農藥的相關系數、檢出限及定量限

2.3.2 基質效應

相比于氣相色譜，液質聯用色譜的基質效應原因為，基質干擾成分的共流出抑制目標物的離子化效率，其存在常會導致檢測結果與實際情況存在誤差[17]。通常情況下，基質效應的評價標準是，基質匹配標準曲線與溶劑標準曲線的斜率的比值越接近1，基質效應越小。若比值＜1表現減弱的基質效應，比值＞1表現增強的基質效應。對桂皮的基質效應進行考察，首先對桂皮空白樣品進行前處理（按1.3節的方法），配制、測定空白基質匹配標準溶液、純溶劑標準溶液。結果顯示，桂皮的匹配標準曲線與溶劑標準曲線的斜率的比值為-6.36～-4.33（＜1），說明其表現出較大的基質抑制效應。因此，試驗采用基質匹配標準曲線進行定量分析，以提高分析結果的準確度和精密度。

2.3.3 加標回收率與精密度

往空白的桂皮基質中添加SLOQ，2倍SLOQ和10倍SLOQ這3個水平的混合標準溶液，各加標水平均做6次平行試驗，并優化條件后測定，結果如表3所示。8種氨基甲酸酯類回收率范圍在71.0%～110.7%，SRSD區間為1.7%～10.3%。如此可見，該方法的準確度、精密度較高，可用于測定樣品中多種農藥殘留。

表3 8種農藥的回收率和相對標準偏差

2.4 樣品的測定

采用建立的方法測定20批市售桂皮樣品中8種農藥殘留，有3批的克百威及其代謝物3-羥基克百威有檢出，檢出值在0.02～0.08 mg/kg，其余農藥尚未有檢出。

3 結論

研究建立了8種氨基甲酸酯類的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）快速篩查方法。乙腈作為提取溶劑，采用改進的QuEChERS凈化方法，UPLC-MS/MS測定。該方法在0.001～0.05 μg/mL范圍內線性關系良好，R2＞0.99，檢出限為0.003～0.007 mg/kg。在SLOQ（0.02 mg/kg），2倍SLOQ（0.04 mg/kg）和10倍SLOQ（0.2 mg/kg）3個添加水平下，8種氨基甲酸酯類在桂皮中的平均回收率均為71.0%～110.7%，SRSD區間為1.7%～10.3%，可應用于實際樣品的檢測。