超臨界CO2萃取竹葉花椒揮發油的成分和分子光譜分析

李潮俊 ，周孟焦，張玉，陳凱，康明，梁曉峰 *

1. 四川中醫藥高等?？茖W校川西北中藥材資源研究與開發利用實驗室，綿陽市中藥資源開發利用重點實驗室（綿陽 621010）；2. 西南科技大學材料與化學學院（綿陽 621010）

竹葉花椒（Zanthoxylum armatumDC.）為蕓香科花椒屬植物，主要分布在我國秦嶺以南的廣大西南地區[1]，其根、莖、葉、果實、種子均可入藥，同時也是一種廣受歡迎的調味料，在食品、農業、醫藥、保健等領域具有巨大發展潛力[2]。近年來，對竹葉花椒揮發油的研究取得積極進展。竹葉花椒揮發油是其香氣的主要來源，是鑒定竹葉花椒品質的重要依據，同時在抗炎鎮痛、殺蟲抑菌等方面有著重要應用[3-7]。對竹葉花椒揮發油的組成成分及其指紋圖譜研究，是深入認識竹葉花椒的基礎，也是拓展其綜合應用領域的關鍵。

超臨界CO2萃取集萃取、分離技術為一體，有著綠色、無毒害、產率高等優點，較低的萃取溫度、無溶劑污染及無氧環境能最大程度地保護天然活性成分，因此常被用在天然活性成分的提取上[8-9]，因其綠色環保、工藝簡單、自動化程度高，被廣泛應用于工業生產。

為建立竹葉花椒揮發油的成分和指紋圖譜，進一步發揮竹葉花椒價值，提高竹葉花椒揮發油利用率，以竹葉花椒果皮為原材料，采用超臨界CO2萃取法從竹葉花椒果皮中提取揮發油樣品，利用GC-MS、紅外光譜、拉曼光譜等技術對其進行分析和探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

干燥的竹葉花椒果皮（幺麻子食品股份有限公司，產地為四川省眉山市洪雅縣）；CO2氣體（純度99.99%，食品級，昌俊氣體有限公司）；無水乙醇（分析純，成都市科隆化學品有限公司）。

1.1.2 主要儀器與設備

HA120-50-05型超臨界萃取裝置（南通市華安超臨界萃取有限公司）；FT-IR5700紅外光譜儀（美國熱電儀器有限公司）；QP2020氣相色譜-質譜聯用儀（日本Shimadu公司）；In Via型激光拉曼光譜儀（英國雷尼紹公司）。

1.2 方法

1.2.1 超臨界CO2萃取法提取竹葉花椒揮發油

HA120-50-05型超臨界萃取裝置自帶兩級分離系統及分離釜Ⅰ、分離釜Ⅱ，在不調節分離系統溫度、壓力的情況下會從分離釜Ⅰ中得到揮發油，此時分離釜Ⅱ中無產物。通過調節分離釜Ⅰ的溫度、壓力，影響超臨界流體的溶質能力，可在分離釜Ⅰ將揮發油中的雜質分離出來，揮發油隨超臨界流體通向分離釜Ⅱ中進行分離。通過調整工藝參數，獲得2種工藝條件的揮發油。其一是使用超臨界萃取裝置，在萃取時間80 min、萃取溫度25.5 ℃、萃取壓力25.5 MPa條件下，從分離釜Ⅰ中得到的揮發油，編號C1。其二是在同樣萃取條件下進行萃取，通過調節分離釜Ⅰ中的溫度、壓力，在萃取的同時對揮發油進行分離純化，從分離釜Ⅱ中得到的純化后的揮發油，編號C2。

1.2.2 GC-MS分析

用移液槍取0.1 mL揮發油樣品，用乙醇定容至10 mL備用。

氣相色譜條件：非極性SH-RXi-5Sil MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫60 ℃，保持1 min，以4 ℃/min升至120 ℃，以5 ℃/min升至200 ℃，保持1 min；載氣為高純氦氣，柱流量1.0 mL/min，進樣口溫度230 ℃，不分流進樣，接口溫度240℃，溶劑延遲時間3.0 min。

質譜條件為：EI電子源，電離能70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍（m/z）35～450 amu。

1.2.3 紅外光譜分析

采用液膜法，先壓制空白溴化鉀片，在測試時用微型移液槍取少量待測樣品涂抹在空白溴化鉀片上，紅外掃描波長范圍400～4 000 cm-1，分辨率0.4 cm-1。

1.2.4 拉曼光譜分析

拉曼測試條件：激光波長785 nm，物鏡放大倍數50 倍，采譜范圍400～3 000 cm-1，分辨率1～2 cm-1。

2 結果與分析

2.1 GC-MS結果分析

通過計算機檢索，利用NIST-17數據庫匹配進行定性分析（選擇匹配度＞80%），將各組分相對含量按照峰面積歸一法計算，結果見表1。

表1 GC-MS檢測結果

接表1

由表1給出的數據可知，從C2和C1中共鑒定出62種化合物，分別占揮發油總量的91.85%和88.64%。以芳樟醇為主的醇類化合物占揮發油總量的52.83%和55.18%，β-水芹烯和D-檸檬烯為主的烯烴類占32.16%和25.98%，還有一些烷烴類、醛酮類、酯類物質。兩者揮發性成分相同，僅在相對含量上有所區別，C2中β-水芹烯、D-檸檬烯、β-月桂烯等烯烴類成分的相對含量有所增加。

2.2 紅外光譜分析

揮發油C2和C1的紅外光譜圖如圖1和圖2所示。C2在3 404，2 970，2 925，2 858和919 cm-1附近出現5個強紅外吸收峰，在1 672，1 640，1 451，1 411，1 375，1 236，1 172，1 114和995 cm-1附近出現9個中等強度的紅外吸收峰，在3 086，2 731，1 728，1 546，835，736和689 cm-1附近出現7個強度弱的紅外吸收峰。C1在3 391，3 086，3 012，2 970，2 923，2 855，2 732，1 738，1 670，1 632，1 551，1 450，1 376，1 239，1 177，1 116，994，920，838，737和690 cm-1附近出現紅外吸收峰。兩者的紅外吸收峰的數量和峰強基本一致，說明2種條件下獲得的揮發油的成分基本相同。

圖1 揮發油C1的紅外光譜圖

圖2 揮發油C2的紅外光譜圖

樣品紅外光譜反映化合物的分子振動情況，對于每一種分子的官能團，都具特定振動頻率。2 970 cm-1和2 925 cm-1兩處的強峰為CH3和CH2的反對稱伸縮振動，1 451 cm-1和1 375 cm-1附近的峰歸屬于CH3的不對稱變角振動和對稱變角振動。3 404 cm-1強且寬的單峰為O—H伸縮振動，1 411 cm-1處的峰可歸屬于C—OH面內彎曲振動，1 114 cm-1可歸屬為醇類C—OH伸縮振動，這應該是芳樟醇等醇類物質的特征振動。3 086 cm-1處強度較弱的吸收峰屬于烯烴類化合物==CH2反對稱伸縮振動，1 640 cm-1處可歸屬于C==C伸縮振動，同時995 cm-1和919 cm-1處的強吸收峰為烯烴類CH2的扭曲振動和面外搖擺，這應該是烯烴類化合物的特征振動。2 731 cm-1處弱而尖銳的峰為醛基上C—H的伸縮振動峰，1 728 cm-1處的紅外吸收峰屬于C==O振動吸收峰區域，1 236和1 172 cm-1處的吸收峰為脂肪酸酯的C—O—C伸縮振動，這應該是揮發油含有的酮醛及酯類化合物的特征振動[10]。C1和C2同為超臨界CO2萃取物，從紅外光譜圖比較，C2的紅外吸收峰更加清晰，這是由于超臨界裝置的工藝設置，使通過分離釜Ⅱ收集的樣品C2去除一些非揮發性的物質，這與GC-MS分析的結果一致。

2.3 拉曼光譜分析

拉曼光譜技術是一種原位測試技術，反映物質的分子振動規律，其測試結果與紅外光譜具有互補性。從拉曼光譜圖中，可以看出C1光譜中，具有CH3、CH2、C==C、C—O—C、C==O等基團的特征光譜，在1 635，1 449，1 380，1 297，1 257，1 175和1 156 cm-1處出現散射峰，C2中具有CH3、CH2、C==C基團的特征光譜，在1 675，1 637，1 455，1 380和1 290 cm-1處出現散射峰。

其中，1 675和1 637 cm-1來自于C==C伸縮振動（環己烯的拉伸和乙烯基的拉伸），1 455 cm-1來自于CH2的彎曲振動。1 290 cm-1來自于(CH2)2的面外彎曲振動，1 380 cm-1來自于CH3的彎曲振動[11-15]。依據表1數據，C2中主要成分有芳樟醇（47.18%）、β-水芹烯（13.77%）、D-檸檬烯（8.13%）、月桂烯（1.89%）、松油烯-4-醇（1.66%）、石竹烯（1.48%）、α-松油醇（1.11%）、β-蒎烯（0.8%）等。其中，芳樟醇含量最高，而在1 675，1 637，1 380和1 290 cm-1處的峰能與其特征峰位很好地對應。C1樣品的拉曼光譜圖中1 257，1 175和1 156 cm-1處出現3個散射峰主要是來自于C—O—C、C==O及一些含氮基團的振動，可能是受到物質純度或者熒光的影響，在C1樣品的拉曼圖中沒有觀察到這3個散射峰。

圖3 揮發油C1的拉曼光譜圖

圖4 揮發油C2的拉曼光譜圖

表2 揮發油拉曼譜帶及其歸屬[16, 18-19]

3 結論

超臨界CO2萃取竹葉花椒揮發油中主要含有醇類、烯烴類物質，還有少量酮醛類、酯類等物質，其中含量較多的成分有芳樟醇（47.18%和48.51%）、β-水芹烯（13.77%和10.77%）、D-檸檬烯（8.13%和6.51%）等。GC-MS從2種超臨界揮發油種共鑒定出62種化合物，分別占揮發油總量的91.85%和88.64%，2種超臨界條件下，揮發油成分相同，但相對含量發生變化。紅外光譜和拉曼光譜分析顯示揮發油的主要官能團，為揮發油成分研究提供參考。