L-賴氨酸天門冬氨酸鹽質(zhì)量規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)制定

潘丙珍，鮑佳生，黃雄俊，盧麗

廣州海關(guān)技術(shù)中心（廣州 510623）

L-賴氨酸是組成蛋白質(zhì)的常見氨基酸之一，是谷物中的第一限制氨基酸，在谷物類食品中強(qiáng)化賴氨酸，是提高其蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的有效途徑。我國在20世紀(jì)末開始重視賴氨酸的強(qiáng)化，一般為L-賴氨酸的鹽酸鹽。L-賴氨酸鹽酸鹽存在有一定程度不良臭味，且在體內(nèi)代謝后釋放的鹽酸可能導(dǎo)致高氯性酸中毒等缺點(diǎn)，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。L-賴氨酸天門冬氨酸鹽沒有不良?xì)饷粒环矫姘l(fā)揮賴氨酸提高谷物食品蛋白質(zhì)效價的功能，另一方面又增加天門冬氨酸的生理功效[1～5]。日本將L-賴氨酸天門冬氨酸鹽作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑[6]，GB 14880—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定其可作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑L-賴氨酸的化合物來源[7]，GB 29922—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品通則》將其列入可用于特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的氨基酸——賴氨酸的化合物來源[8]。

由于我國尚無L-賴氨酸天門冬氨酸鹽的產(chǎn)品質(zhì)量規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)，該品種在國內(nèi)生產(chǎn)和使用受到限制，對進(jìn)口產(chǎn)品也因缺乏標(biāo)準(zhǔn)而無法監(jiān)管到位。此次研究主要參考GB 29922—2013和日本食品添加物公定書（第9版），同時參考國際標(biāo)準(zhǔn)及國家標(biāo)準(zhǔn)同類產(chǎn)品質(zhì)量規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合國內(nèi)產(chǎn)品的生產(chǎn)實(shí)際和使用情況，初步確定L-賴氨酸天門冬氨酸鹽營養(yǎng)強(qiáng)化劑的技術(shù)指標(biāo)和試驗(yàn)方法，標(biāo)準(zhǔn)的制定和頒布實(shí)施將為規(guī)范食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑L-賴氨酸天門冬氨酸鹽產(chǎn)品的生產(chǎn)和監(jiān)管工作提供依據(jù)[9～11]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-賴氨酸天門冬氨酸鹽樣品（寧波盈前科技有限公司、峨眉山市龍騰生物科技有限公司、武漢鑫偉燁化工有限公司、湖北鑫鳴泰化學(xué)有限公司、河南宜新生物科技有限公司）。

正丁醇、乙酸、丙酮、甲醇、甲酸、高氯酸、鹽酸、硫酸、硝酸、硝酸銀（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；茚三酮（阿拉丁）；結(jié)晶紫（上海遠(yuǎn)航試劑廠）；L-賴氨酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品、L-天門冬氨酸鈉一水合物標(biāo)準(zhǔn)品、L-賴氨酸天門冬氨酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（阿拉丁）；鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L，中國計量科學(xué)研究院）；砷標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L，中國計量科學(xué)研究院）。

FP115干燥箱、VD115真空干燥箱（德國BINDER公司）；NICOLET 6700紅外光譜分析儀（美國Thermo公司）；AUTOPOL Ⅵ旋光儀（美國RUDOLPH公司）；PHS-3C酸度計（上海虹益）；FO610C馬弗爐（日本yamato公司）；900T石墨爐原子吸收光譜儀（美國PE公司）；ELAN-DRC-e電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國PE公司）；9130原子熒光光譜儀（北京吉天公司）。

1.2 檢測方法

1.2.1 鑒別試驗(yàn)

1.2.1.1L-賴氨酸天門冬氨酸鹽鑒別

稱取0.1 g（精確至0.001 g）試樣，加水溶解并定容至100 mL。取5 mL試樣溶液于試管中，加入1 mL茚三酮溶液（1 g/L），沸水浴加熱3 min。溶液應(yīng)呈紫色。

1.2.1.2L-賴氨酸及L-天門冬氨酸鑒別

稱取0.1 g（精確至0.001 g）L-賴氨酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品及0.1 g（精確至0.000 1 g）L-天門冬氨酸鈉一水合物標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解并定容至100 mL，以該混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對照溶液。稱取0.2 g試樣，加水溶解并定容至100 mL，作為試樣溶液。吸取對照溶液、試樣溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠板GF254上，在層析缸以展開劑（V正丁醇∶V乙酸∶V水=2∶1∶1）展開至少15 cm。取出晾干，在80 ℃干燥箱加熱30 min。噴以茚三酮的乙酸-甲醇溶液（1 g茚三酮，加3.0 mL乙酸，用甲醇溶解并稀釋至100 mL），在80 ℃干燥箱加熱10 min。至斑點(diǎn)出現(xiàn)，立即檢視。在自然光下觀察硅膠板。在試樣溶液與對照溶液相對應(yīng)的位置應(yīng)觀察到2個主要斑點(diǎn)[12]。

1.2.1.3 紅外鑒別

紅外光譜分析的測定按GB/T 32199—2015《紅外光譜定性分析技術(shù)通則》中的執(zhí)行，以溴化鉀壓片，用紅外光譜分析儀測定，試樣譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖比較，兩者應(yīng)基本一致。

1.2.2L-賴氨酸天門冬氨酸鹽含量（以干基計）的測定

稱取0.2 g（精確至0.000 1 g）試樣于錐形瓶中，加入3 mL甲酸和50 mL乙酸，溶解混勻。加3滴結(jié)晶紫-乙酸指示劑（5 g/L），以0.1 mol/L高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，溶液顏色由紫色經(jīng)藍(lán)色變?yōu)榫G色為終點(diǎn)。同時進(jìn)行空白試驗(yàn)。

L-賴氨酸天門冬氨酸鹽（以干基計）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w1，按式（1）計算。

式中：V1為試樣溶液消耗高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積，mL；V0為空白溶液消耗高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積，mL；c為高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；9.310為每1 mL的0.1 mol/L高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)于9.310 mg的L-賴氨酸天門冬氨酸鹽（C10H21N3O6）；m為試樣質(zhì)量，g；w2為L-賴氨酸天門冬氨酸鹽干燥減量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.2.3 比旋光度的測定

稱取4 g（精確至0.001 g）經(jīng)真空干燥后的試樣，加入6 mol/L鹽酸溶液溶解，調(diào)節(jié)溶液溫度至20 ℃，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶并用6 mol/L鹽酸溶液定容，搖勻。按GB/T 613—2007《化學(xué)試劑 比旋光本領(lǐng)（比旋光度）測定通用方法》規(guī)定的方法測定，計算L-賴氨酸天門冬氨酸鹽的比旋光度。

L-賴氨酸天門冬氨酸鹽的比旋光度αm（20 ℃，D），單位以°·dm2/kg表示，按式（2）計算。

式中：α為旋光儀測得旋光度，°；l為旋光管長度，dm；r為每100 mL溶液中L-賴氨酸天門冬氨酸鹽的質(zhì)量濃度（以干基計），g/mL。

1.2.4 pH測定

稱取1.0 g（精確至0.001 g）試樣，加20 mL水溶解，按GB/T 9724—2007《化學(xué)試劑 pH值測定通則》用酸度計測定pH。

1.2.5 干燥減量的測定

稱取1～2 g（精確至0.000 1 g）試樣，置于已干燥恒重（105±2 ℃，30 min）的稱量瓶中。將試樣在稱量瓶中均勻鋪開。在105±2 ℃、真空壓力低于2.67 kPa條件下干燥3 h。將稱量瓶置于干燥器中冷卻至室溫，稱量，直至恒重。

L-賴氨酸天門冬氨酸鹽干燥減量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w2，按式（3）計算。

式中：m1為稱量瓶和試樣質(zhì)量，g；m2為稱量瓶和試樣干燥后質(zhì)量，g；m0為稱量瓶質(zhì)量，g。

1.2.6 灼燒殘?jiān)臏y定

稱取1～2 g（精確至0.000 1 g）試樣于灼燒至恒重的瓷坩堝中，加幾滴硫酸濕潤試樣，置電爐上緩緩加熱，小心碳化至樣品完全變黑色，冷卻。加1 mL硫酸，加熱直至無煙。將坩堝置馬弗爐內(nèi)550±25 ℃灼燒約3 h，使試樣完全灰化。待爐溫降至200 ℃時，取出放入干燥器內(nèi)冷卻至室溫，稱重。放入馬弗爐內(nèi)，以550±25 ℃灼燒30 min，如前冷卻并稱重。如此重復(fù)操作，直至連續(xù)2次稱重之差不超過0.5 mg為止，記下最低質(zhì)量。

L-賴氨酸天門冬氨酸鹽灼燒殘?jiān)馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)w3，按式（4）計算。

式中：m4為坩堝和試樣灼燒后質(zhì)量，g；m3為坩堝質(zhì)量，g；m5為坩堝和試樣質(zhì)量，g。

1.2.7 氯化物（以Cl計）的測定

稱取0.3 g（精確至0.001 g）試樣置于50 mL納氏比色管中，加硝酸溶液10 mL溶解，加超純水稀釋至50 mL，作為試樣溶液。同時準(zhǔn)確吸取0.35 mL 0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液置于另一支50 mL納氏比色管中，加硝酸溶液10 mL，加超純水稀釋至50 mL，作為對照溶液。分別向試樣溶液和對照溶液中加入1 mL硝酸銀溶液，搖勻，在暗處靜置5 min。將兩管置于黑色背景，自然光照下，自上向下目測比較兩管渾濁度。試樣溶液管渾濁度不深于對照管，即試樣中氯化物含量≤0.041%。

1.2.8 鉛（Pb）的測定

L-賴氨酸天門冬氨酸鹽易溶于水，直接用水或者稀硝酸溶解測試后，石墨爐原子吸收光譜法或者電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定鉛時，存在基體效應(yīng)導(dǎo)致加標(biāo)回收率達(dá)不到要求，所以需要進(jìn)行酸消解去除基體效應(yīng)。

稱取約0.5 g（精確至0.000 1 g）試樣，參照GB 5009.12—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉛的測定》中5.2.2微波消解進(jìn)行前處理，同時做樣品空白。配制5，10，20，40和60 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液，將樣品空白、試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按第一法石墨爐原子吸收光譜法進(jìn)行測試。配制2，5，10，30和100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液，將樣品空白、試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按第二法電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICPMS）測試。結(jié)果計算參照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.9 總砷（以As計）的測定

L-賴氨酸天門冬氨酸鹽易溶于水，直接用水或者稀硝酸溶解測試后，電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定砷時，存在基體效應(yīng)導(dǎo)致加標(biāo)回收率達(dá)不到要求，所以需進(jìn)行消解去除基體效應(yīng)。

稱取試樣約0.5 g（精確至0.000 1 g），參照GB 5009.11—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無機(jī)砷的測定》第一法電感耦合等離子體質(zhì)譜法的5.2.1微波消解進(jìn)行試樣前處理，同時做樣品空白。配制2，5，10，30和100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液，將樣品空白、試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按電感耦合等離子體質(zhì)譜法上機(jī)測試。稱取約1 g試樣于25 mL比色管或50 mL刻度塑料離心管中，用約10 mL去離子水溶解，參照GB 5009.76—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑砷的測定》第二法氫化物原子熒光光度法12.1.1濕法消解，加入硫脲溶液（50 g/L）2.5 mL，用去離子水定容至25 mL刻度并混勻，備測，同時做樣品空白。配制2，5，10，40和60 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液，因試樣前處理方法為用水直接溶解，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液制備不加硫酸。將樣品空白、試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按氫化物原子熒光光度法上機(jī)測試。結(jié)果計算參照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 國內(nèi)外L-賴氨酸天門冬氨酸鹽的技術(shù)指標(biāo)對比

對現(xiàn)行國內(nèi)外有關(guān)法律、法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)情況進(jìn)行查閱，GB 29922—2013規(guī)定可用于特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的L-賴氨酸天冬氨酸鹽質(zhì)量規(guī)格，日本公定書（第9版）制定關(guān)于L-賴氨酸天門冬氨酸鹽的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。研究制定標(biāo)準(zhǔn)草案主要參考GB 29922—2013和日本公定書，其中L-賴氨酸天門冬氨酸鹽含量（以干基計）、比旋光度（以干基計）、pH、干燥減量、灼燒殘?jiān)U和砷這幾個項(xiàng)目和指標(biāo)參考GB 29922—2013。在此基礎(chǔ)上，參考日本公定書，增加鑒別氯化物（以Cl計）。對于干燥減量、灼燒殘?jiān)U和砷這4個項(xiàng)目，GB 29922—2013的規(guī)定比日本公定書要求更為嚴(yán)格。標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)與特醫(yī)食品相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)銜接，因此，干燥減量、灼燒殘?jiān)U和砷指標(biāo)參考GB 29922—2013。研究制定標(biāo)準(zhǔn)與國內(nèi)外L-賴氨酸天門冬氨酸鹽的技術(shù)指標(biāo)對比如表1所示。

表1 國內(nèi)外L-賴氨酸天門冬氨酸鹽標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)指標(biāo)對照表

2.2 國內(nèi)外L-賴氨酸天門冬氨酸鹽標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法對比

對于各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)的試驗(yàn)方法，研究制定標(biāo)準(zhǔn)草案中比旋光度（以干基計）、pH、氯化物（以Cl計）、鉛（Pb）和總砷（以As計）等效采用國家標(biāo)準(zhǔn)的方法。L-賴氨酸天門冬氨酸鹽含量（以干基計）、干燥減量、灼燒殘?jiān)捎萌毡竟〞ǖ?版）的方法。鑒別方法中第1個方法采用日本公定書方法——茚三酮顯色法，第2個方法由日本公定書（第9版）紙色譜法改成參考中國藥典（2020版）氨基酸鑒別的通用方法-薄層色譜法。因?yàn)樵诜椒?yàn)證過程中，發(fā)現(xiàn)紙色譜法不能有效地分離L-賴氨酸與L-天門冬氨酸，而薄層色譜法能很好地達(dá)到分離效果，并且操作更快捷方便。鑒別試驗(yàn)在日本公定書的基礎(chǔ)上增加紅外光譜法，紅外光譜法是有機(jī)物鑒別有效手段之一，使用廣泛，因此增加該方法。國內(nèi)外L-賴氨酸天門冬氨酸鹽標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法對比見表2。

表2 國內(nèi)外L-賴氨酸天門冬氨酸鹽試驗(yàn)方法對照表

2.3 試驗(yàn)方法驗(yàn)證及產(chǎn)品檢測結(jié)果

L-賴氨酸天門冬氨酸鹽生產(chǎn)工藝主要有2種：第1種是以游離L-賴氨酸和L-天門冬氨酸為原料，經(jīng)過中和、濃縮、結(jié)晶制得；第2種是L-賴氨酸鹽酸鹽離子交換后與L-天門冬氨酸經(jīng)中和、濃縮、結(jié)晶而制得。標(biāo)準(zhǔn)起草過程中共收集到5個廠家、2種不同工藝生產(chǎn)的L-賴氨酸天門冬氨酸鹽10批次產(chǎn)品驗(yàn)證試驗(yàn)方法及進(jìn)行產(chǎn)品各指標(biāo)檢測。結(jié)果顯示，各試驗(yàn)方法均能滿足標(biāo)準(zhǔn)要求，合適可行，產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)要求（見表3）。

表3 L-賴氨酸天門冬氨酸鹽產(chǎn)品檢測結(jié)果匯總表

3 討論

L-賴氨酸天門冬氨酸鹽作為食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑L-賴氨酸的化合物來源，用于大米、小麥粉、雜糧粉及其制品和面包中時，技術(shù)指標(biāo)參考日本公定書（第9版）是合適的。但同時L-賴氨酸天門冬氨酸鹽作為可用于特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的氨基酸——賴氨酸的化合物來源，可根據(jù)所使用人群的特殊營養(yǎng)需求添加使用，質(zhì)量規(guī)格必須滿足《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品通則》（GB 29922—2013）中的要求，因此對于干燥減量、灼燒殘?jiān)U（Pb）和總砷（以As計）這4個指標(biāo)，研究制定標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)參考要求更為嚴(yán)格的GB 29922—2013的規(guī)定。在標(biāo)準(zhǔn)研制過程中，對相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行調(diào)研，以及對不同廠家產(chǎn)品進(jìn)行干燥減量、灼燒殘?jiān)U（Pb）和總砷（以As計）這些項(xiàng)目的檢測，結(jié)果表明產(chǎn)品均能滿足標(biāo)準(zhǔn)草案各項(xiàng)指標(biāo)的要求，標(biāo)準(zhǔn)草案指標(biāo)設(shè)置科學(xué)合理。

各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)的試驗(yàn)方法為體現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)用性、統(tǒng)一性原則，盡量與相關(guān)檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)、生產(chǎn)衛(wèi)生規(guī)范相配套、相協(xié)調(diào)，研究制定標(biāo)準(zhǔn)草案中比旋光度（以干基計）、pH、氯化物（以Cl計）、鉛（Pb）和總砷（以As計）等效采用國標(biāo)的方法。日本公定書（第9版）中規(guī)定總砷（以As計）≤3.0 mg/kg，檢測方法為限量法。研究制定標(biāo)準(zhǔn)草案規(guī)定總砷（以As計）≤0.2 mg/kg，檢測方法如選擇限量法顯然不合適，選擇等效采用國標(biāo)通用方法GB 5009.11—2014或GB 5009.76—2014，經(jīng)實(shí)際樣品加標(biāo)回收驗(yàn)證，方法合適。

4 結(jié)論

通過對國內(nèi)外相關(guān)的技術(shù)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)及L-賴氨酸天門冬氨酸鹽生產(chǎn)和使用單位進(jìn)行深入調(diào)研，詳細(xì)了解其生產(chǎn)工藝，在參考國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，同時考慮到國內(nèi)產(chǎn)品實(shí)際情況及我國相關(guān)檢測技術(shù)，參照相關(guān)的國際標(biāo)準(zhǔn)和國際食品安全風(fēng)險評估結(jié)果，充分考慮我國社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平和客觀實(shí)際的需要，科學(xué)制定標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)指標(biāo)及檢測方法。并將收集到的產(chǎn)品對設(shè)置的全部指標(biāo)進(jìn)行方法驗(yàn)證及產(chǎn)品質(zhì)量檢測。遵循公開、公平、公正原則，對標(biāo)準(zhǔn)初稿向社會各界多方面征求意見。標(biāo)準(zhǔn)起草工作科學(xué)、合理、公開、透明。食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑L-賴氨酸天門冬氨酸鹽產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的研制和頒布實(shí)施，將填補(bǔ)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)空白。