紫菜和黑木耳中脂肪提取方法及脂肪酸組成研究

吳麗華，洪霞，王燕姣，馬燕，錢瀅文，何海寧

1. 甘肅中商食品質(zhì)量檢驗檢測有限公司（蘭州 730010）；2. 甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司（蘭州 730010）

研究表明：紫菜中蛋白質(zhì)含量為34%，鐵、磷等維生素含量為24%，具有很高的營養(yǎng)價值，被譽為理想的營養(yǎng)佳品之一[1-3]；紫菜的主要功效有軟堅散結(jié)、清熱化痰、利咽止咳、養(yǎng)心除煩、利水除濕[4-5]，主治癭瘤瘰疬、咳嗽痰稠、咽喉腫痛、煩躁失眠、腳氣水腫、小便淋痛等癥[6-8]。被稱之為“菌中之冠”的木耳，又稱黑木耳，由古書記載，具有“益氣補(bǔ)肌，輕身強(qiáng)志”的功效[9]。黑木耳中碳水化合物含量65%，蛋白質(zhì)含量10.6%，鐵、鈣、磷等微量元素總含量1.86%，還含有豐富的腦磷脂、卵磷脂等營養(yǎng)物質(zhì)，被譽為“素中之葷”[10-12]，其中蛋白質(zhì)、維生素和鐵的含量均比白木耳高出1倍[13-14]，其蛋白質(zhì)中包括多種氨基酸，尤其以天門冬氨酸、谷氨酸、克氨酸、懶氨酸等含量最為豐富[15]。木耳中含有一種特殊的植物膠質(zhì)，有較強(qiáng)的吸附作用，可將殘留在人體消化系統(tǒng)的灰塵雜質(zhì)集中吸附并排出體外，從而起到排毒作用[16]。

對紫菜和黑木耳中主要營養(yǎng)成分的提取和測定方法有很多，如：皮勝濤等[17]采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）聯(lián)用技術(shù)，建立一種優(yōu)化的超聲萃取法測定紫菜中碘含量，該方法簡單、可靠，線性關(guān)系好，檢出限低；曾臻等[18]建立ICP-MS同時測定干紫菜中28種元素的檢測方法，通過對干紫菜中元素含量測定，可為干紫菜質(zhì)量檢測、質(zhì)量評價及其產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)；邱偉芬等[19]以條斑紫菜為原料，采用水提醇沉法提取條斑紫菜粗多糖，用過氧化氫和抗壞血酸聯(lián)合的方法對條斑紫菜粗多糖進(jìn)行降解，對降解多糖進(jìn)行分離純化后，并對純化的組分進(jìn)行化學(xué)成分分析、結(jié)構(gòu)分析、體外免疫活性和體外抗氧化活性研究。

由于紫菜和黑木耳基質(zhì)復(fù)雜、脂肪含量低、提取過程耗時長等特點，對紫菜和黑木耳中脂肪的測定研究很少見諸報道。試驗基于索氏抽提法和酸水解法分別提取紫菜和黑木耳中的脂肪含量，同時對其提取過程中的影響因素進(jìn)行優(yōu)化，并通過氣相色譜儀對其脂肪酸組成成分進(jìn)行定性分析研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫菜、黑木耳樣品各10種（市售）。

石油醚（沸程30～60 ℃，分析純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）；鹽酸、無水乙醚（均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備

JYL-C012粉碎機(jī)（九陽股份有限公司）；XS225A-SCS電子天平（普利賽斯上海天美天平儀器有限公司）；HH-S16S恒溫水浴鍋（金壇市大地自動化儀器廠）；DHG-9073BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療制造有限公司）；Agilent 7890B氣相色譜儀[安捷倫（上海）科技有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 索氏抽提法

樣品處理。將樣品打碎均勻后稱取2～5 g（含油量少的樣品稱樣量相對較大），全部移入濾紙筒內(nèi)，將包好樣品的濾紙筒放入101～105 ℃干燥箱內(nèi)烘4 h至干燥無水[5]備用。

樣品抽提。將濾紙筒放入索氏抽提器的抽提筒內(nèi)，連接已干燥至恒重的平底燒瓶，由冷凝管上端加入石油醚至瓶內(nèi)溶劑的2/3處，于水浴上加熱，使石油醚不斷回流，連續(xù)抽提8 h。取下燒瓶后，回收石油醚，待瓶內(nèi)溶劑剩余1～2 mL時在水浴上蒸干，于100±5 ℃干燥1 h，放干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后稱量。

1.2.2 酸水解法

樣品消化。稱取約2～5 g（含油量少的樣品稱樣量相對較大）試樣置于試管中，加入8 mL水，加入10 mL鹽酸。將試管放入70～80 ℃水浴中，每隔5～10 min攪拌1次，至試樣消化完全。

樣品提取。取出試管，加入10 mL乙醇，冷卻后移入具塞三角瓶中，以25 mL無水乙醚分?jǐn)?shù)次洗試管，一并倒入三角瓶。加塞振搖1 min，放氣后蓋塞靜置12 min，用乙醚-石油醚等比混合液沖洗瓶塞及瓶口附著的脂肪。靜置10～20 min，待分層清晰后，吸出上清液于已恒重的燒杯內(nèi)，加5 mL乙醚-石油醚等比混合液于三角瓶內(nèi)，振搖、靜置后仍將上層液吸出，放入燒杯內(nèi)，蒸干、稱量。

1.2.3 色譜條件

色譜柱HP-88（100 mm×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫150 ℃（2 min）→8 ℃/min→240 ℃（7 min）；汽化溫度250 ℃；檢測溫度250 ℃；氮氣5.0 mL/min；進(jìn)樣方式采用不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL。分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)液及樣品凈化液注入氣相色譜儀中，記錄色譜圖，以保留時間定性，以樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積比較定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫菜脂肪含量提取

試驗探索索氏抽提法和酸水解法提取不同種類紫菜樣品中的脂肪含量（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)），每一樣品重復(fù)測定6次，取其平均值，分別得到標(biāo)準(zhǔn)偏差及實驗室變異系數(shù)（C.V.）。其結(jié)果見表1。

通過2種方法對不同種類紫菜中的脂肪含量進(jìn)行提取比較研究，每一樣品重復(fù)測定6次后取其平均值，由表1可知，索氏抽提法的測定結(jié)果均滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中C.V.＜2.7%的要求，酸水解法的結(jié)果同時滿足C.V.＜2.0%的要求。其中，索氏抽提法對10種紫菜樣品中的脂肪提取含量在0.11～0.21 g/100 g范圍內(nèi)，而酸水解法測得的10種紫菜樣品中的脂肪含量在2.63～2.76 g/100 g范圍內(nèi)，這是由于酸水解法能同時提取游離態(tài)脂肪和飽和態(tài)脂肪，因此，酸水解法更適合于紫菜中脂肪含量的提取。

表1 索氏抽提法和酸水解法提取紫菜中脂肪含量比較

2.2 黑木耳脂肪含量提取

用索氏抽提法和酸水解法提取10種黑木耳樣品中的脂肪含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），每一樣品重復(fù)測定6次取平均值，其標(biāo)準(zhǔn)偏差及CV見表2。

表2 索氏抽提法和酸水解法提取黑木耳中脂肪含量比較

通過2種方法對不同種類的10種黑木耳中脂肪含量進(jìn)行提取比較研究，由表2可知，索氏抽提法測得10種黑木耳樣品中的脂肪含量范圍為0.07～0.16 g/100 g，其結(jié)果均滿足GB/T 27404—2008中C.V.＜2.7%的要求，而酸水解法測得的結(jié)果也均滿足標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008中C.V.＜2.0%的要求，10種黑木耳樣品中的脂肪含量在2.18～2.37 g/100 g范圍內(nèi)，由于酸水解法能同時提取游離態(tài)和結(jié)合態(tài)脂肪，使其更適合用于黑木耳中脂肪含量的充分提取。

2.3 提取過程中影響因素的優(yōu)化

2.3.1 索氏抽提法提取過程中影響因素的優(yōu)化

考察水分對樣品中脂肪含量提取的影響。將裝有樣品的濾紙筒放入103 ℃干燥箱內(nèi)烘4 h，選取脂肪含量相對較高的7號紫菜樣品和9號黑木耳樣品為對象進(jìn)行分析研究，如圖1所示。結(jié)果表明，水分對樣品中脂肪含量提取影響很大，這是由于在提取過程中可能出現(xiàn)的水包油情況導(dǎo)致樣品中的脂肪提取不完全。

圖1 水分對樣品中脂肪含量提取的影響

2.3.2 酸水解法提取過程中影響因素的優(yōu)化

考察不同消化時間對樣品中脂肪含量提取的影響。選取1號紫菜樣品（0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 h）和7號黑木耳樣品（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 h）為研究對象。如圖2所示，隨著消化時間的增大，脂肪含量不斷增大，且在3.0 h后黑木耳中脂肪含量最高且不再增加，表明已提取完全，因此，試驗選擇3.0 h為最優(yōu)消化時間；而紫菜的最優(yōu)消化時間為5.0 h，其脂肪含量不再上升，達(dá)到提取完全的效果。

圖2 不同消化時間對樣品中脂肪含量提取的影響

考察不同溶劑在提取脂肪含量過程中的影響。方法1：試樣消化結(jié)束后，加入10 mL乙醇，冷卻后移入具塞三角瓶中，用25 mL無水乙醚分?jǐn)?shù)次洗試管，一并轉(zhuǎn)移至三角瓶，振搖提取后，用乙醚沖洗瓶塞及瓶口附著的脂肪，靜置后將上層液吸出，加5 mL無水乙醚于三角瓶內(nèi)重復(fù)提取。方法2：加10 mL乙醇于消化好的試樣，冷卻后移入具塞三角瓶中，用25 mL無水乙醚分?jǐn)?shù)次洗試管后轉(zhuǎn)移至三角瓶振搖提取，用乙醚-石油醚等比混合液沖洗瓶塞及瓶口附著的脂肪，靜置后將上層液吸出，加5 mL乙醚-石油醚等比混合液于三角瓶內(nèi)重復(fù)提取。以1號紫菜和7號黑木耳樣品為例，由圖3可知，2種溶劑對樣品中脂肪含量的提取效果無明顯差異，含量基本相同。但在振搖提取過程中，采用方法2提取方式可避免發(fā)生乳化現(xiàn)象，沖洗附著在瓶壁上的脂肪效果較好。

圖3 不同提取溶劑對樣品中脂肪含量提取的影響

2.4 氣相色譜法對紫菜和黑木耳中脂肪酸成分的測定

試驗將酸水解法提取的紫菜和黑木耳中的脂肪酸根據(jù)GB 5009.168—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測定》中規(guī)定的第三法進(jìn)行樣品前處理后，利用氣相色譜儀對紫菜和黑木耳中脂肪酸成分進(jìn)行定性分析研究，如圖4所示：紫菜中脂肪酸主要包括葵酸甲酯、十五碳酸甲酯、亞麻酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、花生酸甲酯、棕櫚一烯酸甲酯、山崳酸甲酯，其中山崳酸甲酯含量最高。而黑木耳中脂肪酸主要包括硬脂酸甲酯、十六碳酸甲酯、油酸甲酯、棕櫚一烯酸甲酯、花生酸甲酯、亞麻酸甲酯，其中含量最高的是花生酸甲酯。

圖4 紫菜和黑木耳中脂肪酸成分定性研究色譜圖

3 結(jié)論

試驗分別采用索氏抽提法和酸水解法，同時優(yōu)化提取條件，對10種紫菜和黑木耳中的脂肪含量進(jìn)行對比提取，采用氣相色譜法將兩種樣品中的脂肪酸組成成分進(jìn)行定性分析研究。結(jié)果表明，酸水解法更適合于紫菜和黑木耳樣品中脂肪含量的測定，利用氣相色譜法對提取的脂肪酸成分進(jìn)行定性分析研究，與34種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比發(fā)現(xiàn)：紫菜中脂肪酸主要包括葵酸甲酯、十五碳酸甲酯、亞麻酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、花生酸甲酯、棕櫚一烯酸甲酯、山崳酸甲酯，其中，山崳酸甲酯含量最高。而黑木耳中脂肪酸主要包括硬脂酸甲酯、十六碳酸甲酯、油酸甲酯、棕櫚一烯酸甲酯、花生酸甲酯、亞麻酸甲酯，其中含量最高的是花生酸甲酯。相比于索氏抽提法，酸水解法除了提取游離態(tài)脂肪外，還能提取樣品中的結(jié)合態(tài)脂肪，耗時短，靈敏度高，測得結(jié)果更為準(zhǔn)確，尤其對脂肪含量較低的樣品酸水解法提取效果更好，有望應(yīng)用于其他樣品中脂肪含量的測定。