雞肉凍干粉中磺胺類藥物殘留標準物質的研制

賈潤宇，呂錚，王一名，余麗波，張凡，余洋*

1. 中國檢驗檢疫科學研究院（北京 100176）；2. 中檢科（北京）測試認證有限公司（北京 100176）

磺胺類藥物具有抗菌譜廣、藥效穩定、療效確實、價格低廉、使用方便等[1-2]優點，使其在畜牧及動物醫療領域得到廣泛應用。磺胺類獸藥能通過動物代謝從而污染環境，破壞生態環境，影響人身健康[3-5]。因此，對動物源中磺胺藥物殘留開展嚴密監控對保障食品質量安全和人民身體健康具有重要意義。為保證監測結果的準確可靠，需要相應的標準物質作為支撐，然而查閱國家標準物質資源共享平臺[6]，未見動物源基體標準物質。國內對于獸藥殘留基體標準物質的研究及研制尚處在初級階段。郭德華等[7]研制含氯霉素、克倫特羅和沙丁胺醇的魚粉標準物質；李杰[8]研制含磺胺類及雌激素類獸藥的動物性食品標準物質樣品；李蘭英[9]研制含磺胺類獸藥的豬組織基體標準物質樣品；呼念念[10]研制含硝基呋喃類獸藥的雞肉標準物質樣品。在基體標準物質方面，只有蜂蜜和牛乳粉國家標準物質，無法滿足基質中磺胺類藥物殘留的準確測定。因此，試驗應用真空冷凍干燥技術、均勻化技術，以雞肉為本底基質制備雞肉中磺胺類藥物殘留標準物質，并經均勻性檢驗、穩定性檢驗和實驗室聯合定值[11-12]，該標準物質可用于實驗室質量控制、能力驗證等，對于我國的獸藥殘留檢測技術的提升具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

磺胺甲基嘧啶固體標準品（純度99.8%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；磺胺二甲基嘧啶固體標準品（純度99.8%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；甲酸（分析純）、磷酸鹽緩沖液[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；Na2EDTA緩沖液（天津市百世化工有限公司）。

雞肉購買于超市。

MSM764M斬拌機（北京馬多機械制造有限公司）；ms205du精密電子天平（瑞士mettler toledo公司）；B50C多功能食品攪拌機（北京永興食品機械公司）；wizord2.0真空冷凍干燥系統（美國SP scientific公司）；GM 300刀式均質粉碎儀（德國Retsch公司）；v100高效混合機（廣州市旭朗機械設備有限公司）；800/2s深凹型雙室真空包裝機（諸城市匯品機械有限公司）；FSH-2高速勻漿機（上海汗諾儀器有限公司）；Vortex-Genie2漩渦混合器（美國Scientific Industries公司）；LYNX4000離心機（美國Thermo公司）；LCMS-8045液相色譜-串聯質譜聯用儀（日本島津公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 基質樣品研制

將20 kg不含磺胺類藥物的雞肉放入斬拌機并將其打碎成肉泥，分別稱取計算好的各磺胺類藥物標準品，用甲醇溶解后緩慢滴加到雞肉泥中，使用多功能食品攪拌機進行攪拌，攪拌時間為2 h，使其充分混勻，使用真空冷凍干燥機制成雞肉凍干粉中磺胺藥物標準物質，具體流程見圖1。

圖1 樣品制備流程圖

1.2.2 標準物質中磺胺類藥物檢測

1.2.2.1 樣品處理

提取。稱取1 g（精確至0.01 g）凍干粉樣品，加8 mL Mcllvaine Na2EDTA緩沖液，渦旋1 min，超聲20 min，在-2 ℃，10 000 r/min離心5 min，收集上清液。殘渣中加8 min磷酸鹽緩沖液，重復提取1次，合并提取液，混勻，備用。

凈化。固相萃取柱依次使用甲醇和水活化，取備用液過柱，依次用水5 mL和20%甲醇水溶液淋洗，抽干，用洗脫液10 mL洗脫。收集洗脫液，于40 ℃水浴氮吹至近干，用初始流動相復溶，渦旋溶解后過濾膜備用。

1.2.2.2 儀器工作條件

1.2.2.2.1 液相色譜條件

色譜柱C18（150 mm×2.1 mm×1.7 m）；柱溫35℃；進樣量10 μL；流速0.3 mL/min；流動相A相為甲醇-乙腈（2∶8，含0.1%甲酸，體積比），B相為0.1%甲酸水溶液。

洗脫梯度（0～5 min，90% B相至10% B相；5～10 min，10% B相至70% B相，10～12 min，70% B相至40% B相；12～13 min，40% B相至0 B相；13～14 min，0B相至90% B相）。

1.2.2.2.2 質譜條件及參數

電噴霧離子源（electrosprayionization，ESI）；多反應監測（multi-reactionmonitoring，MRM）模式；正離子模式；霧化器流量3 L/min；干燥器流量10 L/min；加熱器流量10 L/min；接口溫度300 ℃；接口電壓4.0 kV；其他質譜采集參數見表1。

表1 磺胺甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶的質譜分析條件參數

1.2.3 均勻性和穩定性試驗

1.2.3.1 均勻性檢驗

參考GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導則（3）標準樣品 定值的一般原則和統計方法》[13]，從制備的樣品中隨機抽取10袋，每袋重復測定3次，分析樣品中磺胺類藥物含量。所有樣品以隨機次序在重復性條件下測試，選擇不低于定值方法精密度和靈敏度的測量方法，按照上述檢測方法對樣品進行均勻性檢測，檢測數據用單因素方差分析法來判斷標準物質是否均勻[13]。

1.2.3.2 穩定性檢驗

依據GB/T 15000.3—2008[13]的規定，采用不同溫度的方式，模擬檢測樣品運輸過程中的短期穩定性，采用不同時間間隔的方式，模擬檢測樣品儲存過程中的長期穩定性。

短期穩定性：樣品在原本正常儲存溫度下放置72 h后，選擇10，20，40和60 ℃共4個溫度點，模擬運輸中遇到的極端溫度，采用隨機抽樣方式每個取樣點均設置3個樣品，平行測定2次，進行樣品的短期穩定性分析[14]。

長期穩定性：在室溫下，選擇0，1，3，5，7，9和12月共7個取樣時間點，采用隨機抽樣方式每個取樣點均設置3個樣品，平行測定2次，進行樣品的長期穩定性分析。

式（1）～（4）依次分別表示為：穩定性評估基本模型；回歸方程斜率計算方法；回歸方程截距計算方法；標準偏差s（β1）計算方法，其中s表示直線上每個點的標準偏差，計算見式（5）。

式中：X為測量的時間；Y為標準物質的特性值；Xi為每次測量的時間；Yi為每次測量時標準物質的特性值；X為測量時間的平均值；Y為標準物質特性值的平均值；β0為回歸方程的截距；β1為回歸方程的斜率；n為測量次數；s(β1)為n次測量結果的標準偏差；s為直線上每點的標準偏差。

1.2.4 基質樣品定值

標準物質定值依據GB/T 15000.3—2008[13]的規定，標準物質的定值采取6家實驗室聯合測定的方法，每家發2個樣品，每個樣品測3次，出具6個數據，各實驗室均按照GB/T 20759—2006《畜禽肉中十六種磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》[15]或GB/T 21316—2007《動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》[16]進行檢測。分別使用夏皮洛-威爾克（Shapiro-Wilk）法、科克倫（Cochran）法、狄克遜（Dixon）法檢驗各實驗室的組內數據是否為正態分布、各實驗室間的數據是否等精度、各實驗室間的數據是否有離群值，在滿足上述條件的情況下對各實驗室組間的數據進行正態性檢驗。對滿足所有條件的實驗室數據進行平均值計算，結果即為該樣品定值結果[13-14]。

依據相關標準，試驗中不確定度包括均勻性引入的不確定度、穩定性引入的不確定度、定值引入的不確定度。

2 結果與分析

2.1 雞肉中磺胺類藥物基質標準物質色譜圖

運用儀器檢測方法對制備的磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶基質標準物質進行測試，磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶純標準品及試驗制備的基質標準物質質譜圖見圖2和圖3。磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶色譜圖峰形尖銳對稱，保留時間附近未出現干擾峰，基線平穩，表明定量數據具有一定準確性。二級質譜圖中的碎片離子的質荷比與標準物質所產生的碎片離子偏差小，表明能準確定性基質標準物質中含有磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶。

圖2 純標準品和基質標準物質中磺胺甲基嘧啶的儀器檢測結果圖

圖3 純標準品和基質標準物質中磺胺二甲基嘧啶的儀器檢測結果圖

2.2 均勻性檢驗結果

均勻性檢測結果詳見表2和表3。

表2 樣品中磺胺甲基嘧啶項目均勻性檢測結果單位：μg/kg

表3 樣品中磺胺二甲基嘧啶項目均勻性檢測結果單位：μg/kg

2.3 穩定性檢驗結果

2.3.1 短期穩定性

短期穩定性檢測結果詳見表4和表5。

表4 樣品中磺胺甲基嘧啶項目短期穩定性測試結果 單位：μg/kg

表5 樣品中磺胺二甲基嘧啶項目短期穩定性測試結果 單位：μg/kg

2.3.2 長期穩定性

長期穩定性檢測結果詳見表6和表7，長期穩定趨勢圖見圖4。

圖4 磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶長期穩定趨勢圖

表6 樣品中磺胺甲基嘧啶項目長期穩定性測試結果 單位：μg/kg

表7 樣品中磺胺二甲基嘧啶項目長期穩定性測試結果 單位：μg/kg

2.4 定值結果

雞肉凍干粉中磺胺類獸藥殘留基質標準物質6家實驗室定值結果詳見表8和表9。

表8 各定值實驗室檢測雞肉凍干粉中磺胺甲基嘧啶的測試結果

表9 各定值實驗室檢測雞肉凍干粉中磺胺二甲基嘧啶的測試結果

對各實驗室數據進行Shapiro-Wilk法檢驗，經計算各實驗室W＞W(6,0.95)，表示在顯著性水平α=0.05上符合正態分布；對各實驗室數據平均值用Cochran法檢驗，經計算C＜C(0.05,6,6)，表示各實驗室間的測量屬于等精度測量；對各平均值數據用Dixon法檢測，經計算滿足r1＜f(0.05,6)且rn＜f(0.05,6)，表示各實驗室間的測量無顯著性差異。

對各實驗室數據進行Shapiro-Wilk法檢驗，經計算各實驗室W＞W(6,0.95)，表示在顯著性水平α=0.05上符合正態分布；對各實驗室數據平均值用Cochran法檢驗，經計算C＜C(0.05,6,6)，表示各實驗室間的測量屬于等精度測量；對各平均值數據用Dixon法檢測，經計算滿足r1＜f(0.05,6)且rn＜f(0.05,6)，表示各實驗室間的測量無顯著性差異。

2.5 不確定度

試驗中不確定度包括均勻性引入的不確定度、穩定性引入的不確定度、定值引入的不確定度，計算詳見式（6）～（8），再計算出標準物質的合成標準不確定度，計算詳見式（9）。

式中：MSamong為樣品間均方；MSwithin為樣品內均方；n為測量次數；s(β1)為穩定性測量結果的標準偏差；t為穩定性測量的時間；s為定值結果的標準偏差。

經計算，研制的標準物質各項不確定度及定值結果詳見表10和表11。

表10 雞肉凍干粉中磺胺甲基嘧啶標準物質各項不確定度及定值結果 單位：μg/kg

表11 雞肉凍干粉中磺胺二甲基嘧啶標準物質各項不確定度及定值結果 單位：μg/kg

3 結論

通過對相關標準的學習與研究，制備雞肉凍干粉中磺胺類獸藥殘留基體標準物質，將雞肉通過打碎、加標、凍干等一系列制備步驟后制得標準物質，經過均勻性及穩定性檢驗后，判斷結果是否滿足相關標準，通過6家實驗室聯合定值的方式對標準物質進行定值和不確定度評估，結果滿足動物源性食品中獸藥殘留檢測標準。該標準物質可用于實驗室內考察檢測儀器、檢測方法及人員能力，對于提高基體標準物質定值的測量準確度和我國獸藥殘留檢測技術的提升有著重要意義。