超臨界CO2提取牡丹花精油及其抗氧化活性研究

王春杰，張立攀，趙夢瑤，王俊鵬，李冰，胡桂芳

河南省商業科學研究所有限責任公司（鄭州 450000）

牡丹（Paeonia sufruticosaAndr.）為毛茛科芍藥屬植物，原產于我國，其顏色艷麗，被譽為“花中之王”[1]。牡丹花精油是從牡丹花瓣中提取分離出的具有芳香氣味的揮發性油狀物質。經研究，天然牡丹花精油具有較強的抗氧化、抗衰老等生理活性，可以緩解肌膚衰老、改善人體血液循環、促進細胞再生，在化妝品、保健品、功能食品等方面有著很好的應用前景[2-3]。2013年“丹鳳”牡丹花被批準成為新食品原料[4]，前期已開展“香玉”牡丹花新食品原料申報工作；在緩解品種單一這一問題后，開發牡丹花香精產品，成為牡丹食品產業的緊迫需求。研究牡丹花精油及其提取工藝，是研發牡丹香精和化妝品的重要前提。

牡丹花精油的提取方法有多種。水蒸氣蒸餾法因其操作簡便、成本較低、設備簡單，是最為常見的一種精油提取方法，但其提取效率低、能耗較高，熱敏性成分在高溫下易受到破壞[5]。有機溶劑提取法具有較高的提取率，但易產生溶劑殘留，尤其不利于在食品領域的應用[6]。超臨界二氧化碳流體萃取法（supercritical carbon dioxide fluid extraction，SFE-CO2）是借用超臨界狀態下CO2所具有的特異溶解性，對植物中的揮發性成分進行提取，通過調節溫度和壓力使溶解在超臨界CO2中的植物精油與氣化的CO2分開，達到選擇性提取、分離化合物的目的；在提取過程中溫度較低，可有效防止熱敏組分分解，而且所得精油無溶劑殘留，是一種高效綠色的提取技術。該技術已被應用于中藥功能活性物質和香茅精油、迷迭香精油、玫瑰花精油、茉莉花精油等植物精油的提取[7-11]。

已有文獻報道SFE-CO2提取牡丹籽油的工藝研究[12-15]，但應用于牡丹花精油的還較少。采用SFECO2法，在單因素試驗基礎上，以精油提取率為指標，對牡丹花精油提取工藝進行響應面優化，并通過Design-Expert軟件對試驗數據進行回歸分析，獲得最佳工藝。通過測定牡丹花精油對DPPH自由基的清除作用，對其抗氧化活性進行研究，為牡丹花精油開發及其利用，尤其是牡丹花精油在食品和化妝品方面的運用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡丹花（品種為“香玉”，采摘無污染、無蟲、無病牡丹花的盛開花朵，采摘時間為上午10點以前、下午4點鐘以后，采自河南省洛陽祥和牡丹科技有限公司牡丹種植基地）；CO2（純度99.99%，河南源正特種氣體有限公司）；二苯代苦味麟自由基[DPPH，純度＞97%，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司]；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）。

Spe-edTMSFE-2型超臨界CO2提取裝置（美國應用分離公司）；LGJ-12真空冷凍干燥機（北京松源華興科技發展有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；FA2004電子天平（上海衡際科學儀器有限公司）；QJ-08B粉碎機（上海兆申科技有限公司）；標準型分樣篩（上虞市五四儀器廠）；AL204-ICF分析天平（梅特勒-托利多國際貿易有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 牡丹花預處理

取新鮮牡丹花瓣，在真空冷凍干燥機中進行凍干處理，壓力5 Pa，溫度-35 ℃，時間15 h。凍干后的花瓣用粉碎機研碎，過篩，取0.300～0.425 mm孔徑（40～50目）干粉，作為提取原料備用。

1.2.2 超臨界CO2提取牡丹精油

稱取5 g牡丹花凍干粉（0.300～0.425 mm，即40～50目）裝入提取釜、密封，CO2氣體經加熱加壓后通入釜中，待釜內達到設定的溫度和壓力后，進行連續提取，開啟提取釜出口閥門，設置CO2流量5 L/min，動態提取一定時間后收集牡丹花精油，稱其質量。按式（1）計算牡丹花精油提取率。

牡丹花精油提取率=牡丹花精油質量（g）/牡丹花粉末質量（g）×100% （1）

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 溫度對提取率的影響

采用動態提取方式，固定壓力25 MPa、時間1.75 h、CO2流量5 L/min、收集閥溫度130 ℃，分別考察不同溫度（30，35，40，45，50和55 ℃）對牡丹花精油提取率的影響，按照1.2.2的步驟提取牡丹花精油，并計算提取率。

1.2.3.2 壓力對提取率的影響

采用動態提取方式，固定溫度40 ℃、時間1.75 h、CO2流量5 L/min、收集閥溫度130 ℃，分別考察不同壓力（10，15，20，25，30和35 MPa）對牡丹花精油提取率的影響，按照1.2.2的步驟提取牡丹花精油，并計算提取率。

1.2.3.3 時間對提取率的影響

采用動態提取方式，固定溫度40 ℃、壓力25 MPa、CO2流量5 L/min、收集閥溫度130 ℃，分別考察不同時間（1.75，2.00，2.25，2.50，2.75和3.00 h）對牡丹花精油提取率的影響，按照1.2.2的步驟提取牡丹花精油，并計算提取率。

1.2.4 響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，以提取率為評價指標，時間、壓力、溫度為自變量，設計響應面試驗，試驗因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平表

1.2.5 數據分析

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，結合單因素試驗結果，選取時間、溫度、壓力3個因素為自變量，以牡丹花精油提取率（Y）為響應值，運用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行回歸分析并得到最佳提取工藝參數。每組試驗重復3次，結果取平均值。

1.2.6 牡丹花精油對DPPH自由基清除能力測定

配制DPPH乙醇溶液：準確稱取6 mg DPPH，用無水乙醇定容至250 mL，得到60 μmol/L的DPPH乙醇溶液；置于0～4 ℃避光保存，現配現用，4 h內有效。

配制測試液：將牡丹花精油用無水乙醇進行稀釋，分別得到質量濃度為5.62，2.81，1.40，0.70，0.35，0.18和0.09 mg/mL的待測液。

牡丹花精油對DPPH自由基清除能力的測定，參考毛文岳等[16]的方法。準確量取1 mL待測液、1 mL無水乙醇，分別與1 mL DPPH 乙醇溶液混勻，反應30 min后，在517 nm處測定吸光度，分別記為A1和A2；量取1 mL待測液與1 mL無水乙醇混勻，反應30 min后在517 nm 處測定吸光度A0，用無水乙醇調零，以抗壞血酸作為陽性對照，平行操作重復3次。清除率按式（2）計算。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 溫度的影響

由圖1可知，隨著溫度不斷升高，提取率起初呈現上升趨勢，溫度40 ℃時達到最高。這是因為升高溫度可以加快分子運動速率，提高溶質及溶劑分子的擴散能力，使得傳質能力增強，牡丹精油溶出加快[17]。但是，溫度升高也會使超臨界CO2密度降低，溶劑化能力減小，溫度過高時，密度減小的影響更為顯著，導致提取率開始下降。所以溫度選擇40 ℃。

圖1 溫度對牡丹花精油提取率的影響

2.1.2 壓力的影響

由圖2可知，提取率隨著壓力的增加呈現先增加后降低趨勢。壓力增加使得CO2密度增加，有利于傳質、提高提取效率。壓力過大時會導致超臨界CO2黏度增大，影響傳質速率，使得精油溶解度降低，造成提取率低[18]。同時，壓力過高時對設備的要求較高，增加操作時的安全風險。所以壓力選取25 MPa。

圖2 壓力對牡丹花精油提取率的影響

2.1.3 時間的影響

由圖3可知，隨著時間的增加，提取率逐漸增大，時間達到2.5 h后，提取率隨著時間的增加而趨于穩定。這是因為隨著時間的延長，溶質分子在逐漸溶出的過程中逐漸達到飽和[19]。過長的時間會導致CO2的消耗增大，成本增加，因此時間選擇2.5 h。

圖3 時間對牡丹花精油提取率的影響

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面法試驗設計

根據單因素的試驗結果，以牡丹花精油提取率（Y）為響應值，以溫度（A）、壓力（B）和時間（C）為響應因素，通過Design-Expert軟件設計牡丹花精油提取工藝的響應面優化試驗，結果見表2。

表2 Box-Behnken設計及結果

2.2.2 響應面分析

對表2結果進行多元回歸擬合分析，得到模型回歸方程：Y=2.25+0.103 7A-0.021 3B+0.037 5C-0.03AB-0.007 5AC-0.092 5BC-0.092 5A2-0.092 5B2-0.105C2。對回歸模型進行方差分析，結果見表3。此模型P值為0.000 7，小于0.05，說明模型結果顯著，具有統計學意義。失擬項P值為0.828 9，大于0.05，結果不顯著，說明該模型與試驗結果擬合程度較好，無失擬因素。R2=0.095 29，調整決定系數Radj2=0.892 3，大于0.80，進一步證明該模型與試驗結果擬合程度較好，可用來對牡丹花精油SFE-CO2提取工藝進行分析和預測。根據表3中F值可知，影響提取率大小的因素依次為時間（A）＞壓力（C）＞溫度（B）。此外，通過P值可知A、BC、A2、B2、C2對精油提取率有極顯著影響（P＜0.01），C對精油提取率有顯著影響（P＜0.05）。

表3 回歸模型方差分析表

為考察溫度、壓力和時間及交互作用對提取率的影響，通過Design-Expert軟件繪制任意2個因素交互作用對提取率影響的響應面圖及等高線圖，如圖4所示。

模型的響應曲面與等高線的形狀能夠反映因素變量對響應值的影響和因素之間交互作用的顯著性，即曲面越陡，因素的影響越顯著；等高線圖為橢圓形且曲率越大代表兩者交互作用強[20]。由圖4（a和b）可知，等高線沿A軸變化比B軸、C軸都更加密集，表明時間比溫度和壓力對響應值的影響均要大，AB、AC的交互作用都不很顯著。圖4（c）中等高線呈橢圓形，表明溫度和壓力之間的交互作對牡丹花精油的提取率影響最大，這與表3中的結果相一致。BC的F值為17.85，遠高于AB和AC的F值，表明BC的交互作用影響最強，要大于AB、AC的交互作用。

圖4 兩因素交互作用對牡丹花精油提取率的影響

根據響應面試驗分析得到最優的超臨界CO2提取牡丹花精油的工藝條件：時間2.65 h、溫度38.1 ℃、壓力26.6 MPa。軟件預測該條件下牡丹精油提取率為2.29%。為了驗證軟件預測結果的可靠性，結合實際操作，將最優工藝條件調整為溫度38 ℃、壓力27 MPa、時間2.7 h。在最優工藝下進行3次平行試驗，所得牡丹花精油的平均提取率為2.26%，與理論值相接近，說明該工藝條件準確可靠。

2.3 牡丹花精油對DPPH自由基清除能力測定

由圖5可知，在牡丹花精油濃度在0.09～2.81 mg/mL范圍內，隨著牡丹花精油濃度的增加，精油對DPPH自由基清除率逐漸增高，質量濃度達到2.81 mg/mL時，DPPH自由基清除率為72.6%，隨著精油濃度繼續增加，精油對DPPH自由基清除率呈現逐漸穩定趨勢。通過SPSS統計軟件進行回歸分析，得到牡丹花精油的IC50為1.783 mg/mL。相比于VC來說，牡丹花精油對DPPH自由基的清除作用較弱。

圖5 牡丹花精油對DPPH自由基的清除作用

3 結論

通過單因素試驗和響應面法優化超臨界CO2提取牡丹花精油的工藝條件，方差分析結果表明，影響提取率大小的因素依次為時間（A）＞壓力（C）＞溫度（B）。壓力和溫度之間具有較強的交互作用。結合Design-Expert軟件預測的結果及實際操作的可行性，將最終的優化工藝定為溫度38 ℃、壓力27 MPa、時間2.7 h。超臨界CO2法提取得到的牡丹花精油具有較強的抗氧化活性，IC50為1.783 mg/mL。試驗結果為牡丹花精油的生產、加工提供一定的理論依據，促進牡丹的精深加工。