不同時期NICS 檢測在平衡易位患者PGT 治療中的臨床應用

李明穎 ，李敏瑤 ，晏家驄 ，田 美 ，李永剛

（1）云南省第一人民醫院生殖醫學科，云南 昆明 650032;2）云南大學生命科學學院，云南 昆明 650500）

平衡易位（reciprocal translocation）是常見的一種染色體結構異常，在新生兒中，平衡易位攜帶者發生率約為0.2%[1]。平衡易位通常發生在非同源染色體片段交換時，若易位沒有造成遺傳物質的獲得或者丟失，且易位的斷點沒有導致基因的截斷，則攜帶患者表型正常。然而研究表明，平衡易位攜帶患者不孕及反復流產（recurrent pregnancy loss，RPL）的風險顯著增加。據報道，RPL 患者的染色體異常以染色體結構異常為主，其中以平衡易位的檢出最多。在有反復流產史的夫婦中，一方為平衡易位攜帶者的比例約為2.5%～3.2%[2]。另外，當染色體易位的斷裂點與生殖的基因有關時，患者還會表現為不孕不育。

平衡易位配子經過減數分裂，理論上可形成18 種配子。同正常配子結合后，形成的合子包括一種完全正常，一種易位攜帶，其余均為遺傳物質不平衡。因而，理論上，若夫妻雙方一方為平衡易位攜帶者，其獲得遺傳物質平衡胚胎的比例僅為2/18[3]。如果不進行干預，平衡易位攜帶者的妊娠結局主要有自然流產、復發性流產、生育缺陷兒等[3?4]，其中，自然流產率可達50%-80%；常見胎兒異常有心臟發育異常、神經發育遲滯、先天愚型等等；性染色體相關的平衡易位會導致不孕的風險，這些都給患者夫婦家庭造成嚴重的經濟和精神壓力。

隨著人類輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）的發展，ART 技術已經不僅僅用于不孕患者的治療，而是更多的參與到優生優育的干預中來。在ART 治療周期中，非整倍體是導致種植失敗和流產的重要原因之一。因此，建立一套有效的鑒別整倍體胚胎的方法，對于改善ART 周期臨床結局非常關鍵[5]。近年來，隨著植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）的出現及推廣，通過檢測胚胎染色體，有效的減少了染色體異常胚胎移植的比例，進而降低了平衡易位攜帶者自然流產以及不良孕產的發生比例。針對平衡易位患者，可以進行PGTSR（Structural rearrangements）的治療，通過對染色體拷貝數變異（copy number variants，CNVs）進行檢測，選擇遺傳物質平衡的胚胎移植[6]。PGT 的檢測樣本主要來源于囊胚滋養外胚層（trophectoderm，TE）細胞的活檢，二代測序技術（next-generation sequencing，NGS）經過有效性的驗證，已廣泛應用于臨床PGT 的檢測。然而，盡管囊胚活檢技術是目前進行PGT 的主流方法，但是對于胚胎來說仍是一項有創的操作，對于活產胎兒及其后期發育的影響尚不明確；另外，囊胚活檢操作的技術難度大，所需設備昂貴，這也限制了該項技術在生殖中心的普遍應用。因此，建立一種無創的、快速簡易的、成本更低的評估胚胎染色體的方法，將成為ART 領域的重大突破。

無創胚胎染色體篩查（non-invasive chromosome screening，NICS）是指通過結合NGS 技術，檢測培養至囊胚期時培養液中游離的DNA（cell-free DNA，cfDNA），以cfDNA 的檢測結果來反映整個胚胎的染色體情況，在不進行活檢的前提下，得到胚胎染色體的篩查結果，作為甄選移植胚胎的參考條件。有研究表明，NICS 技術在染色體篩查方面可以達到0.882 的敏感度和0.840 的特異度[7]，然而由于該項技術創立及應用時間還較短，其有效性還有待驗證。隨著技術的不斷改進提升，該技術的精度和深度也可不斷提高。

本研究以傳統囊胚TE 細胞活檢/未形成囊胚的廢棄整胚的染色體測序結果為對照，利用NICS 技術對胚胎的不同階段培養液進行測序檢測，探討不同時期培養液NICS 檢測技術在平衡易位患者治療中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究以2018 年3 月至2020 年7 月在云南省第一人民醫院生殖醫學科進行PGT 治療的10位平衡易位攜帶患者為研究對象，共收集186 條測序數據。根據檢測樣本，將所有數據分成3 組，包括D3 培養液測序結果（D3 NICS）39 條，D5 培養液測序結果（D5 NICS）72 條，胚胎/TE 測序結果75 條；其中，同時有D3 NICS 和胚胎/TE 測序結果的胚胎36 個，同時有D5 NICS 和胚胎/TE 測序結果的胚胎69 個，3 種測序結果都有的胚胎30 個。

本研究已獲得云南省第一人民醫院醫學倫理委員會批準，所有參與患者均已簽署相關知情同意書。

1.2 研究方法

胚胎采用微滴法培養，D3 胚胎轉入囊胚培養液后，回收D3 培養液，放入含有5 μL 細胞裂解液的PCR 管中并做好標記；囊胚活檢后，回收對應活檢胚胎的囊胚培養液，放入含有5 μL 細胞裂解液的PCR 管中并做好標記；囊胚培養結束后，收集未形成囊胚的整胚及對應培養液，放入含有5 μL 細胞裂解液的PCR 管中并做好標記，以上樣本由第三方冷鏈運輸公司運至生物公司進行培養液濃度測定和染色體非整倍體分析。

對測序結果進行2 個變量的分析，分別為檢測結果和CNVs 結果。其中，檢測結果根據是否檢測成功分為檢測失敗（N/A）和檢測成功（非N/A）；對檢測成功（非N/A）的數據進行CNVs 結果的分析，根據測序結果分為異常（染色體CNVs 非平衡）、正常（染色體CNVs 完全正常/平衡易位攜帶）。

1.3 統計學處理

本研究采用SPSS 20.0 軟件進行數據分析，其中計數資料用例數和百分數[n（%）] 表示，各組結果的差異分析用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各類型樣本檢測結果分布

在3 組檢測結果中，D3 NICS 的檢測失敗率最高，達到38.46%；在胚胎/TE 組中，僅有2 例樣本檢測失敗，均為活檢（TE）樣本，可能與活檢樣本取樣數量少和操作損傷有關。在染色體CNVs 結果上，D3 NICS 檢出的異常率最低，僅為25.64%，這同D3 培養液中DNA 數量較少有關。從整體結果分布來看，3 組的檢測結果和CNVs結果之間差異均有統計學意義（P<0.001/P<0.01），且D3 NICS（a）同胚胎/TE 組的檢測結果和CNVs結果的差異都有統計學意義，D5 NICS 同胚胎/TE組的檢測結果和CNVs 結果的差異沒有統計學意義，同時D3 NICS 同D5 NICS 的檢測結果和CNVs 結果的差異也有統計學意義，見表1。

表1 各組樣本CNV 檢出結果匯總[n（%）]Tab.1 Summary of CNV results in different groups [n（%）]

2.2 相同胚胎培養液同胚胎結果比較

2.2.1 相同胚胎的D5 培養液同胚胎/TE 結果比較在測序結果中，同時含有D5 NICS 和胚胎/TE 檢測結果的胚胎有69 個，共有138 條檢測數據。2 組的檢測結果之間的差異無統計學意義（P=0.085），D5 NICS 組檢測失敗率（N/A%）略高于胚胎/TE 組（10.14%/2.90%），2 組的CNVs 結果分布之間的差異也無統計學意義（P=0.944），見表2。

表2 相同胚胎D5 NICS 和胚胎/TE 測序結果比較[n（%）]Tab.2 Comparison of sequencing results between D5 NICS group and embryo/TE from the same embryo [n（%）]

2.2.2 相同胚胎的D3 培養液同胚胎/TE 結果比較在測序結果中，同時含有D3 NICS 和胚胎/TE 檢測結果的胚胎有36 個，共有72 條檢測數據。2 組檢測結果之間的差異有統計學意義（P<0.001），D3 NICS 組的檢測失敗率（N/A%）高于胚胎/TE 組（41.67%/2.78%），2 組之間CNVs 結果的分布差異也具有統計學意義（P<0.01），見表3。

表3 相同胚胎D3 NICS 和胚胎/TE 測序結果比較[n（%）]Tab.3 Comparison of sequencing results between D3 NICS group and embryo/TE from the same embryo [n（%）]

2.2.3 相同胚胎的3 組數據結果比較在測序結果中，同時含有D3 NICS、D5 NICS 和胚胎/TE 檢測結果的胚胎有30 個，共有90 條檢測數據。3組檢測結果和CNVs 結果之間的差異均有統計學意義（P<0.01/P<0.01），且D3 NICS 組和胚胎/TE 組之間的差異有統計學意義，D5 NICS 組和胚胎/TE 組之間的差異無統計學意義。分別重新對D3 NICS 和胚胎/TE，以及D5 NICS 和胚胎/TE 檢測結果和CNVs 結果進行兩組間χ2檢驗，結果表明，在檢測結果和CNVs 結果兩個變量上，D3 NICS 和胚胎/TE 之間的差異均有統計學意義（P<0.01/P<0.05），D5 NICS 和胚胎/TE 染色體CNVs結果之間的差異均無統計學意義（P=0.085/P=0.658），見表4。

表4 不同階段 NICS 同胚胎/TE 測序結果比較[n（%）]Tab.4 Comparison of sequencing results in NICS groups of different stages and embryo/TE group [n（%）]

3 討論

目前，平衡易位患者可以通過PGT 檢測，移植遺傳物質平衡的胚胎，從而減少早期流產的發生。由于PGT 治療過程中的胚胎活檢操作為有創性操作，有些研究認為該操作會降低胚胎質量，引起種植失敗[8?9]；在動物模型的研究表明，活檢胚胎操作可能引起表觀遺傳改變和神經退行性組織、腎腺的紊亂，以及卵巢功能缺陷等[10]。因而，尋找一種可替代的無創檢測方法是PGT 治療的主要的發展方向之一。2020 年，Rubio 等[11]發表了一項多中心前瞻性研究結果表明，胚胎cfDNA 分析得到的CNVs 與相應TE DNA 的染色體分析一致率為78.2%（866/1108）。2021 年，Chen等人研究結果提示，活檢細胞檢測和NICS 檢測與整胚檢測一致性之間的差異均沒有統計學意義[12]。

目前，對于NICS 的研究多取材于D5 培養液，本研究中，筆者將D3 培養液同樣納入研究范疇，在獲得的186 條測序數據中，包括D3 NICS 結果39 個，D5 NICS 結果72 個，胚胎/TE 測序結果75 個。從整體結果來看，3 組數據的檢測失敗率（N/A%）和CNVs 結果分布的差異均有統計學意義（P<0.001/P<0.01），這種差異主要來自于D3 NICS 組和胚胎/TE 組之間的差異，D5 NICS 組和胚胎/TE 組之間的差異沒有統計學意義（P>0.05）。

為了評估D3 NICS 和D5 NICS 的用于臨床診斷的準確性，筆者以同一胚胎的胚胎/TE 的CNVs 結果作為對照進行分析。結果表明，D5 NICS 的CNVs 結果分布同胚胎/TE 結果相比，二者之間的差異沒有統計學意義（P=0.994）；但是，D3 NICS 的CNVs 結果分布同胚胎/TE 結果相比，其差異有統計學意義（P<0.01）。有研究表明，相對于D3 培養液，D5 培養液對一些特定基因的檢測更為可靠[13]，筆者的結果也從CNVs 的角度驗證了D5 NICS 診斷的可靠性。D5 NICS 的檢測結果同胚胎/TE 檢測結果更接近，具有替代活檢操作進行胚胎染色體CNVs 診斷的應用潛能，但D3 NICS 的檢測結果準確性較低，無法用于臨床診斷。

在檢出率方面，Luca Galluzz 等[13]在2015 年的研究中表明，D3 胚胎培養液和D5 胚胎培養液中gDNA 檢出率分別為93.7% 和94.4%，gDNA含量僅分別為（80±70）pg 和（99±113）pg，但二者之間的差異沒有統計學意義。由于培養液中cfDNA 含量較少，在現有測序深度和技術的前提下，檢測失敗率要高于活檢樣本。在筆者的研究結果中，D5 NICS 檢測失敗率略高于胚胎/TE 組（10.14%/2.90%），但2 組之間的差異沒有統計學意義（P=0.085）；D3 NICS 的檢測失敗率高于胚胎/TE，其差異有統計學意義（41.67%/2.78%，P<0.001）。有研究表明，隨著培養時間的延長，DNA 降解比例會更高[10]。在筆者的研究中，D3培養液收集時間大約在72 h，D5 培養液收集時間約為48～72 h，D3 培養液中更多的DNA 降解比例也可能會影響最終結果的檢出率和準確性。

目前，cfDNA 分泌的機制尚不明確，大部分的觀點認為cfDNA 主要來源于胚胎發育過程中產生的凋亡細胞。有跟蹤研究表明，凋亡胚胎的來源主要是后續發育成胎兒的內細胞團（inner cell mass，ICM）[14]。另外，活檢采集的TE 細胞數目有限，無法反映整個胚胎的染色體情況，可能會造成錯誤的遺傳診斷。對于ICM 和TE 的研究表明，二者染色體的一致率在62.1%～86.2%不等[14?17]。因而相對于TE 活檢，培養液中的cfDNA 更能反映ICM 的染色體情況。Shitara 等[18]在2021 年的研究發現，以培養到第10 天的胚胎為對照，相對于TE 活檢結果，培養液檢測的結果更為可靠。

筆者的研究表明，從檢測失敗率和CNVs 結果分布來看，D5 NICS 同胚胎/TE 之間的差異沒有統計學意義；相對于D3 NICS，D5 NICS 在平衡易位患者胚胎的診斷上更有優勢，具有替代活檢操作進行PGT 診斷的潛能。在臨床應用上，母源DNA 污染和培養液中較低的cfDNA 含量是限制NICS 臨床應用的最大因素。NICS 檢測技術準確度的提高，依賴于受精方法、培養方法和樣本處理方法的優化和測序技術的進步。隨著測序技術的發展，測序深度和精度在不斷提高，NICS 技術作為無創的染色體診斷技術，在平衡易位患者的治療中，將有著更為普遍的應用前景。