不同濃度的牙髓干細胞成骨能力的研究

錢石兵，張凌鵬，殷凌云，李昌全，李 虎，于鴻濱

（昆明市延安醫院，昆明醫科大學附屬延安醫院 口腔科，云南 昆明 650051）

臨床中因為牙體牙髓、牙周等疾病導致的牙槽骨缺損已經屢見不鮮，這為后續的修復造成了嚴重的不便，進而影響患者的生理和心理健康[1]。盡管自體骨的移植療效可能是更好的，但其對供區造成一定的創傷，一些骨替代材料開始運用于臨床。其中Bio-Oss 無機小牛骨顆粒被普遍用于臨床，得到國際的廣泛認可[2]。Bio-Oss 骨粉具有超級多孔結構，有助于間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）爬行附著于骨粉表面分化形成新骨。牙髓干細胞（dental pulp stem cell，DPSC）是一類具有高度的分化能力的牙源性干細胞，如神經細胞、脂肪細胞、成骨和軟骨細胞、血管細胞和牙本質細胞等[3，4]。多項研究證明Bio-Oss 骨粉與DPSC 具有良好的相容性、可行性和安全性，能夠有效促進骨修復和愈合，顯示出良好的應用前景[5?7]。但是鮮有文獻提及Bio-Oss 骨粉與DPSC 的合適配比，若配比不合適，則會影響成骨的速度和效率。因此，本課題擬初步探究Bio-Oss 骨粉與DPSC 的大致配比，以期為臨床應用提供有價值的信息。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

0.25%胰蛋白酶（BI，以色列）；磷酸鹽緩沖液（PBS，索萊寶）；α-MEM 培養基（Gibco，美國）；胎牛血清（BI，德國）；Human MSC Analysis Kit（BD，美國）；Human MesenCult? Osteogenic Differentiation Kit（Stemcell，加拿大）；Human MesenCult? Adipogenic Differentiation Kit（Stemcell，加拿大）；茜素紅（索萊寶）；油紅O（索萊寶）；酶聯免疫檢測儀（Thermo，美國）；流氏細胞儀（BD，美國）；堿性磷酸酶活性檢測試劑盒（碧云天）；GFP 慢病毒（吉凱，中國）。

1.2 方法

1.2.1 DPSC 的分離、培養及鑒定經昆明醫科大學附屬延安醫院倫理委員會審批通過，患者監護人簽字同意，在口腔外科收集新鮮拔除、無牙體牙髓及牙周疾病且根尖未發育完全的第三磨牙。迅速用含2%雙抗的α-MEM 培養基保存放入冰盒中，隨即在細胞工作間中處理標本。用含2%雙抗PBS 沖洗徹底清除血凝塊并刮除根面軟組織，使用咬骨鉗將牙齒劈開，獲取無損傷的牙髓組織，使用1 mL 注射器反復搗碎牙髓組織，轉移至培養皿中倒置放入37 ℃細胞培養箱中溫育15 min，加入含20% FBS 的培養基，動作輕柔勿使組織塊浮起，每3 d 換液，待細胞大量爬出后消化細胞傳代擴大培養。

流式細胞術鑒定：取第4 代DPSC 消化、離心，PBS 重懸，制備成單細胞懸液計數備用。以每管5×105個細胞數加入流式管內，根據試劑操作說明，加入CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105 抗體，避光孵育30 min。加入鞘液清洗1 遍，棄上清，然后加入200～300 μL 的鞘液上機，檢測細胞表面抗原，進行免疫表型分析。

1.2.2 DPSC 成骨、成脂向分化取第4 代DPSC，每孔5×105個細胞接種于6 孔板內，待細胞融合在 80%以上時更換 Human MesenCult?Osteogenic Differentiation Kit 和Human MesenCult? Adipogenic Differentiation Kit，對照組正常培養，連續培養3 周后吸棄培養基并用PBS漂洗，加入70%乙醇固定細胞2 h，PBS 洗3 遍，加入茜素紅和油紅O 染色5 min，倒置顯微鏡下觀察染色的面積大小以及顏色深淺。

1.2.3 GFP 病毒轉染DPSC根據吉凱病毒轉染手冊，預實驗摸得GFP 病毒轉染DPSC 的MOI=10。取24 孔板，每孔接種4×104個細胞，細胞融合至90%左右加入嘌呤霉素，設置0.25 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、1.5 μg/L、2 μg/L 濃度，摸得48 h殺死全部細胞的最低濃度為0.5 μg/L。取第3 代DPSC 和6 孔板，每孔接種5×105個細胞，計算并加入相應的慢病毒體積，轉染96 h 后換液，加入0.5 μg/L 嘌呤霉素培養基，殺死野生型細胞。

1.2.4 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性檢測取24 孔板，每孔加0.05 g 骨粉鋪滿孔板底，成骨培養基浸潤骨粉后，分別加入1×105、2×105、4×105、8×105個細胞，對照組不加骨粉，其余條件一致培養。分別在培養第3 天和第7 天時用1%×-Trition 裂解細胞，4 ℃下，14000 g離心3 min 后取上清，按照碧云天堿性磷酸酶試劑盒操作說明測定ALP 活性。

1.2.5 SEM 掃描DPSC 在骨粉表面黏附的情況按照同上條件，Bio-Oss 和DPSC 復合培養7 d 后，小心吸棄培養液，每孔加入1 mL 賽維爾掃描電鏡固定液，4 ℃ 固定細胞4 h 后送至賽維爾生物公司進行掃描電鏡。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 DPSC 的培養及多向分化能力鑒定

牙髓組織采用組織塊法貼壁培養5 d 后鏡下可見類成纖維樣的細胞沿著組織塊邊緣呈放射狀爬出（圖1A），傳代后細胞生長速度加快（圖1B）。對照組則無紅色的顆粒（圖1C）。細胞連續誘導成骨3 周后茜素紅染色后可見大量明顯紅色的顆粒（圖1D），對照組則未見染紅的脂滴（圖1E），細胞向成脂誘導3 周后油紅O 染色后可見有脂滴被染紅（圖1F）。表明DPSC 具有多向分化潛能，屬于間充質干細胞來源。

2.2 DPSC 表面標記物的檢測

流式細胞術檢測顯示間充質干細胞表面標志物CD73 占99.90%，CD90 占99.96%、CD105 占99.08%，均呈陽性高表達，而造血細胞標記物CD34、CD45 以及免疫細胞表面標記物CD19、CD11b、HLA-DR 則呈陰性（占0.12%），證明屬于間充質干細胞家族，排除造血來源的干細胞（圖2）。

圖2 流式鑒定DPSC 干細胞標記物Fig.2 Identification of DPSC surface antigen by flow cytometry

2.3 GFP 病毒轉染DPSC 以及DPSC 在骨粉中的生長形態

在轉染GFP 后，48 h 后熒光顯微鏡下可見散在少量的熒光表達，在96 h 達到高峰（圖3A～3C）。GFP-DPSC 在Bio-Oss 骨粉中可以很好的生長和增殖，隨著培養時間的延長，細胞逐漸爬行至骨粉的深部孔隙之中（圖4A～4B）。

圖3 GFP 轉染DPSC 不同時間熒光表達（×100）Fig.3 Fluorescence expression of GFP transfected DPSC at different time

圖4 GFP-DPSC 在Bio-Oss 骨粉中的生長（×100）Fig.4 Growth of GFP-DPSC in Bio-Oss bone powder

2.4 不同濃度DPSC 成骨分化ALP 活性比較

第3 天和第7 天與對照組相比，DPSC 復合骨粉培養后ALP 活性比對照組高，P<0.05，差異具有統計學意義，說明不同數目的DPSC 復合同樣質量的Bio-Oss 骨粉的成骨能力是不一致的。第3 天時，各組ALP 活性呈指數型曲線，但到第7 天時，4×105和8×105組的ALP 活性并沒有與第3 天時的保持一致，細胞數目翻倍，但8×105組的ALP 活性并沒有翻倍，出現了下降的趨勢（圖5 和圖6）。

圖5 第3 天ALP 活性比較Fig.5 Comparison of ALP activity on day 3

圖6 第14 天ALP 活性比較Fig.6 Comparison of ALP activity on day 14

2.5 SEM 掃描結果

SEM 掃描圖片發現1×105（圖7）和2×105（圖8）組黏附爬行在骨粉表面的細胞數目較少，4×105（圖9）組細胞數目稍多，8×105（圖10）組爬滿整個骨粉表面，部分細胞呈復層生長。細胞在骨粉表面爬行黏附后會伸出偽足與骨粉表面進行連接（圖7～10）。

圖7 1×105 組同一視野下SEM 圖像Fig.7 SEM images of 1×105 groups in the same field of view

圖8 2×105 組同一視野下SEM 圖像Fig.8 SEM images of 2×105 groups in the same field of view

圖9 4×105 組同一視野下SEM 圖像Fig.9 SEM images of 4×105 groups in the same field of view

圖10 8×105 組同一視野下SEM 圖像Fig.10 SEM images of 8×105 groups in the same field of view

3 討論

眾所周知，支架和干細胞是再生工程的兩個關鍵要素，Bio-Oss 骨粉已經被廣泛用于口腔牙槽骨缺損的患者，其臨床療效已經得到認可，能夠有效形成新骨，修復骨缺損[7?9]。Bio-Oss 骨粉作為一種替代的生物材料，具有高柔韌性和可塑性以及最少的感染和免疫反應風險[10，11]。Bio-Oss 骨粉可以為多種MSC 的存活提供良好的環境，MSC 能夠附著在Bio-Oss 支架上增殖和分化[12]。在動物研究中，植入Bio-Oss 骨粉的MSC 增加了支架與宿主骨的整合，并將其形態改變為成骨樣細胞[13]。在體外循環壓縮壓力下，在循環壓縮壓力下，骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）向成骨細胞的分化顯著增加[14]。在上頜竇底提升過程中，植入BMSC 和Bio-Oss 的加壓復合物可促進新骨的形成[15]。在脂肪來源的干細胞（adipose-derived stem cell，ADSC）和Bio-Oss 的復合物局部注射信號素3A（Sema3A）促進了2 型糖尿病的大鼠顱骨骨再生[16]

盡管Bio-Oss 骨粉與MSC 能夠更好的促進成骨，但是很多實驗并未明確指出MSC 的接種數目和合適的Bio-Oss 質量。而且，筆者認為固定質量的Bio-Oss 骨粉所能容納的干細胞數目是有限的，如果干細胞數目過少，則無法充滿骨粉的孔隙，成骨的效率減弱；若干細胞數目過多，則會造成競爭，造成干細胞資源的浪費。另一方面，干細胞的種類也同樣影響接種數目，因為不同的干細胞其大小、增殖能力和分化能力是不一致的[17，18]。ADSC、BMSC 和DPSC 都具有形成礦化組織的能力。然而，對于其礦化組織工程能力的比較研究較少，未得到充分的探索。研究發現，DPSC 的成骨潛能明顯大于BMSC 和ADSC，DPSC 具有產生相對高量礦化基質的最大潛力[19]。將BMSC 和DPSC 聯合Bio-Oss 移植在顱面區域促進骨再生，發現2 組具有相似的骨密度、新骨形成和成骨相關蛋白表達，在體內的骨再生效果相匹配[20]。一項meta 分析評價顯示，與對照組相比，在4 周時，DPSC 與支架復合物的新骨形成顯著增加[21]。但是在閱讀文獻時發現沒有明確的細胞和骨粉用量，作者是否認為這不是一個重要的信息所以沒有描述。如Wang 等[22]僅描述以2 × 106細胞/mL 的密度將BMSCs 懸液加入Bio-Oss 顆粒中，未說明骨粉具體質量，但是DPSC與BMSC 的細胞形態大小以及分化能力是不一致的，所以BMSC 接種的數目對DPSC 而言并沒有太多的指導價值。

Bio-Oss 骨粉作為固體顆粒具有遮光性，普通光鏡下無法看到細胞的狀態，因此本課題預先將GFP 慢病毒成功轉染DPSC 并篩選擴大培養以便于在熒光顯微鏡下觀察。筆者發現大約0.05g的骨粉可以均勻散在的鋪在24 孔板的底部，將細胞數目定為1×105、2×105、4×105、8×105四組。ALP 是成骨分化過程中細胞分泌的的一種酶，它的表達活性是成骨細胞分化、成熟一個非常明顯的特征[23]。在第3 天時，ALP 活性測定的數值發現8×105組幾乎是4×105的兩倍，與細胞數目增長的趨勢大致相同。但是在第7 天時，4×105但8×105組卻沒有出現預期的結果，與第3 天的結果保持一致，反而稍稍出現了一個降低的趨勢，說明隨著培養時間的延長，細胞數目增殖過多，抑制了成骨分化的效率。隔天在熒光顯微鏡下監測GFP-DPSC 在Bio-Oss 骨粉中的生長狀態，發現著培養時間的延長，細胞形態發生了變化，部分逐漸變成了不規則的形狀，不再是長梭形的類成纖維細胞樣形態。Bio-Oss 骨粉之間的孔隙并非完全規則的，并且骨粉作為一種剛性物質，干細胞需要做出改變以適應這樣的結構，而且Bio-Oss 骨粉沒有細胞毒性，并不會影響干細胞的增殖[24]。通過掃描電鏡發現，1×105、2×105兩組細胞較為散在的附著在骨粉表面，4×105組細胞比較密集的附著在骨粉表面，而8×105組則看見細胞堆疊生長。通過放大電鏡下觀察倍數發現，細胞表面可伸出部分偽足附著于骨粉之上，形成更為緊密的連接。

干細胞成骨分化是一個周期較長的過程，細胞逐漸爬行到骨粉更深的內部結構之中，骨粉作為一個立體的物質，熒光顯微鏡下可以在不同層面觀察到細胞，但是這也為筆者無法全面觀察細胞帶了一定的影響。在實驗過程中筆者發現GFPDPSC 和Bio-Oss 骨粉復合物培養時間到成骨中后期，GFP 的熒光強度逐漸減弱，這是由于干細胞分化過程中已經不再是干細胞，而是逐漸變為成骨細胞[25]。另一方面，細胞在誘導分化過程中仍在增殖，因此筆者嘗試連續在成骨培養基中誘導21 d 后用DAPI 染色，在藍色熒光下根據細胞核顯色的數目大致估計培養21 d 后的細胞數目。由于Bio-Oss 骨粉均能被藍色熒光和綠色熒光激發成像，而且在不同層面均能觀察到細胞，這對實驗結果造成了干擾。盡管結果不理想，但仍舊可以作為一個參考，4×105、8×105兩組的細胞可以在鏡下看到密集的藍色的細胞核。

通過以上實驗結果，筆者認為0.05 g Bio-Oss 骨粉接種4×105～8×105個細胞是一個合適的密度范圍，細胞在骨粉中爬行生長需要一定的時間，而且干細胞具有強大的增殖能力，若開始時細胞接種數目過多，則會對細胞的生長和增殖造成抑制，反而影響成骨效率。根據現有的實驗結果，未來還需進行免疫組化和Micro-CT 精細掃描獲得更精確的結果完善實驗完整性。