尿酸酶缺失大鼠腸道菌群的變化

李 丹 ，萬(wàn)緒蓮 ，李律宇 ，云 宇 ，羅光云 ，劉韋兵 ，林公府 ，李 寧 ，黎勇坤 ，段為鋼

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500;2）云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500;3）昆明市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，云南 昆明 650500;4）云南省第一人民醫(yī)院骨科，云南 昆明 650100;5）廣南縣人民醫(yī)院骨科，云南 文山 663300）

高尿酸血癥是危害人類(lèi)健康的“第四高”，與痛風(fēng)、高血壓、糖尿病等常見(jiàn)病關(guān)系密切[1]。高尿酸血癥的有效防治已經(jīng)成為臨床和實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)。雖然基于正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大小鼠，采用藥物或食物建立高尿酸血癥的模型層出不窮[2]，但這些動(dòng)物表達(dá)的尿酸酶則是貼近臨床研究的障礙。近年來(lái)，尿酸酶缺失的大小鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已經(jīng)成功研制[3?4]，但尿酸酶缺失后腸道菌群會(huì)發(fā)生什么改變一直未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。考慮到腸道也是尿酸排泄的重要途徑，腸道菌群可能也具有一定的貢獻(xiàn)[5?6]。本研究以同齡野生型大鼠為對(duì)照，系統(tǒng)觀察尿酸酶缺失大鼠（Kunming-DY，KDY 大鼠）腸道和糞便菌群變化，為進(jìn)一步研究KDY 大鼠血尿酸變化與腸道菌群的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性尿酸酶缺失大鼠，即KDY 大鼠由課題組前期采用CRISPR/Cas9 技術(shù)研制[4]，45 d 日齡，按照SPF 標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，環(huán)境溫度（22±2）℃，模擬自然光照。對(duì)照鼠為雄性SPF 級(jí)SD 大鼠，45 d 日齡，由簡(jiǎn)陽(yáng)達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司提供。

尿酸檢測(cè)試劑盒（磷鎢酸法）購(gòu)自南京建成生物工程研究所，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（K6600A 型）由北京凱奧科技發(fā)展有限公司生成。其他試劑或儀器也均為國(guó)產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)取6 只45 d 日齡雄性KDY 大鼠為尿酸酶缺失組（Uox-/-），隨機(jī)取6 只45 d 日齡SD 大鼠為對(duì)照組（WT）。日齡45 d 時(shí)，稱(chēng)重，收集每只大鼠的新鮮糞便。隨后烏拉坦（1 g/kg）麻醉大鼠，剪開(kāi)腹腔，從腹主動(dòng)脈取血制備血清。其中各組取3 只大鼠腸道（十二指腸到結(jié)腸末端），攤成110 cm（其中小腸90 cm，盲腸10 cm，結(jié)腸10 cm），每5 cm 取樣于試管中。用干冰保存送樣到上海生工生物工程（上海）有限公司提取DNA 進(jìn)行16SrDNA 測(cè)序。

1.3 尿酸測(cè)定

血尿酸按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。

1.4 菌群16SrDNA 高通量測(cè)序

樣品中的DNA 采用E.Z.N.A? Mag-Bind Soil DNA Kit（OMEGA）試劑盒進(jìn)行提取，采用Qubit3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒（Life）對(duì)提取的樣品進(jìn)行精確擴(kuò)增，擴(kuò)增引物選擇原核生物V3～V4 引物（341F：CCTACGGGNGGCWGCAG 和805R：GACTACHVG GGTATCTAATCC 進(jìn)行第1 輪擴(kuò)增。隨后加入Illumina 橋式PCR 兼容引物進(jìn)行第2 輪擴(kuò)增建立DNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序[7]。測(cè)序在數(shù)據(jù)分析上：采用QIIME 進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾掉不符合要求的DNA 序列，應(yīng)用UPARSE 算法一致性水平達(dá)到97%以上的序列進(jìn)行OTU 聚類(lèi)，用UCLUST 分類(lèi)法聯(lián)網(wǎng)與SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析，采用R 語(yǔ)言分析群落組成分。在原核微生物類(lèi)別上根據(jù)算法依次在門(mén)、綱、目、科和屬水平進(jìn)行歸類(lèi)并進(jìn)行相對(duì)豐度（%）計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠血尿酸和體重變化

自由飲食狀態(tài)下，正常野生型SD 大鼠的血尿酸約為11.77～14.69 μg/mL。尿酸酶缺失的KDY大鼠血尿酸水平顯著升高到64.71～78.51 μg/mL之間，部分動(dòng)物已經(jīng)達(dá)到高尿酸血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)（圖1A）。尿酸酶缺失的KDY 大，鼠血尿酸水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。尿酸酶缺失后，比同齡雄性野生型SD 大鼠的體重明顯減輕，即從250 g 減輕到170 g 左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1B。

圖1 KDY 大鼠的血尿酸水平和體重變化[（），n=6]Fig.1 Changes of blood uric acid level and body weight in KDY rats[（），n=6]

2.2 KDY 大鼠腸道菌群變化

從十二指腸開(kāi)始，同齡KDY 大鼠各節(jié)段腸道的微生物分布在門(mén)（圖2A）、綱（圖2B）、目（圖2C）、科（圖2D）和屬（圖2E）水平與SD 大鼠均有明顯不同。總體上看，KDY 大鼠各腸段的微生物多樣性在門(mén)、綱、目、科以及屬水平均呈下降趨勢(shì)。有意思的是與SD 大鼠相比，KDY 大鼠各腸段乳酸菌屬（Lactobacillus）（圖2E）及相應(yīng)的門(mén)（Firmicutes，厚壁菌門(mén)，圖2A）、綱（Bacilli，芽孢桿菌綱，圖2B）、目（Lactobacillales，乳桿菌目，圖2C）、科（Lactobacillaceae，乳桿菌科，圖2D）的豐度也增高。

圖2 KDY 大鼠各腸段菌群豐度變化[（），n=6]Fig.2 Variation of flora abundance in each intestinal segment of KDY rats[（），n=6]

在屬水平統(tǒng)計(jì)細(xì)菌種類(lèi)數(shù)，發(fā)現(xiàn)野生型SD大鼠的細(xì)菌種類(lèi)數(shù)波動(dòng)較大。與野生型SD 大鼠相比，KDY 大鼠各腸段菌群多樣性總體上具有減少趨勢(shì)，其中第9 腸段的菌群種類(lèi)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 KDY 大鼠各節(jié)段菌群屬水平多樣性變化Fig.3 Variation of microflora at genus level in each segment of KDY rats

2.3 大鼠糞便菌群變化

同齡KDY 大鼠新鮮糞便微生物分布在門(mén)（圖4A）、綱（圖4B）、目（圖4C）、科（圖4D）和屬（圖4E）水平均有明顯不同。與腸道菌群變化不同的是，KDY 大鼠糞便中的微生物多樣性呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。從屬水平（圖4E）看，與SD 大鼠相比，KDY 大鼠新鮮糞便克羅諾菌屬（Cronobacter）豐度明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。乳桿菌屬（Lactobacillus）豐度明顯增加，這一點(diǎn)與各腸段的數(shù)據(jù)一致。

與腸道內(nèi)菌群不同的是，野生型SD 大鼠和KDY 大鼠糞便中的克羅諾桿菌屬（Cronobacter，圖4E）豐度均較乳酸桿菌增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其所在的門(mén)（Proteobacteria，變形菌門(mén)，圖4A）綱（Gammaproteobacteria，γ-變形菌綱，圖4B）目（Enterobacteriales，腸桿菌目，圖4C）科（Enterobacteriaceae，腸桿菌科，圖4D）的豐度也增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖4 KDY 大鼠新鮮糞便菌群豐度變化Fig.4 Abundance changes of fresh fecal flora in KDY rats

從物種多樣性看，野生型SD 大鼠與KDY 大鼠新鮮糞便在門(mén)、綱、目、科和屬水平上相比均無(wú)明顯差異（P>0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 KDY 大鼠新鮮糞便不同水平的種類(lèi)差異Fig.5 Species differences of fresh feces in KDY rats at different levels

2.4 乳酸桿菌屬豐度變化

在屬水平，不管是在野生型SD 大鼠還是KDY 大鼠，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）是各段腸中豐度最高的菌屬。特別地，KDY 大鼠各腸段乳酸桿菌均處于較高豐度水平，只有在結(jié)腸以及糞便中才銳減（可能與乳酸桿菌厭氧有關(guān)），但也較野生型SD 大鼠高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 乳酸桿菌屬（Lactobacillus）在各段腸及糞便中的變化趨勢(shì)Fig.6 Change trend of lactobacillus in intestinal tract and feces

3 討論

尿酸酶缺失KDY 大鼠的成功研制為研究高尿酸血癥、痛風(fēng)及相關(guān)疾病提供了較理想的模型動(dòng)物[7?12]。雄性KDY 大鼠血尿酸水平遠(yuǎn)高于野生型SD 大鼠，其血尿酸水平在50～80 μg/mL 之間，與成年男性的血尿酸水平接近[4,12]，但遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道的尿酸酶缺失小鼠[3]。該大鼠斷奶后的1 a 生存率達(dá)90%以上[4]，因此KDY 大鼠可用于高尿酸血癥、痛風(fēng)及相關(guān)疾病的長(zhǎng)期研究。

本研究發(fā)現(xiàn)尿酸酶缺失后，各腸段的菌群多樣性有下降趨勢(shì)，且小腸中段（第9 段，相當(dāng)于空腸和回腸交界處）菌群多樣性下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不同的是，KDY 大鼠新鮮糞便中的菌群多樣性卻基本一致，盡管某些菌群的豐度發(fā)生了較大改變。

尿液和糞便是尿酸排泄的兩個(gè)主要途徑，一般認(rèn)為前者約占2/3，后者約占1/3。筆者用KDY 大鼠證實(shí)，正常KDY 大鼠的尿液尿酸排泄約占90%，糞便尿酸排泄約占10%[12]，這說(shuō)明正常情況下腸道尿酸排泄的地位遠(yuǎn)低于腎臟。特別地，腸道菌群與血尿酸水平的關(guān)系尚不明確。考慮到很多細(xì)菌表達(dá)尿酸酶，寄生在腸道的細(xì)菌可能參與尿酸降解代謝，因此有人認(rèn)為腸道菌群可能有利于血尿酸降低[5?6]。然而筆者前期用雄性KDY 大鼠證明：KDY 大鼠的新鮮糞便含有更多的細(xì)菌，且用抗菌藥物抑制腸道細(xì)菌后血尿酸水平也未發(fā)生明顯變化[13]，這似乎說(shuō)明腸道菌群可能不是影響血尿酸的主要因素（高表達(dá)尿酸酶的基因工程菌除外）。

由于腸道中真菌的豐度極低，本研究只較系統(tǒng)地用16SrDNA 測(cè)序技術(shù)研究了雄性KDY 大鼠的各腸段的細(xì)菌變化。從整體上看，KDY 大鼠各腸段菌屬有減少的趨勢(shì)，但乳酸菌屬的豐度卻總體上高于野生型SD 大鼠。考慮到，大多數(shù)乳酸菌屬于益生菌，該菌屬的增加可能有利于維持KDY 大鼠的腸道健康[14]，從而降低其他致病菌或條件致病菌如假單胞菌（Pseudomonas）、支原體（Mycoplasma）、棒狀桿菌（Corynebacterium）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）、鏈球菌（Streptococcus）、草螺菌（Herbaspirillum）、梭菌（Clostridiales）、羅思氏菌屬（Rothia）和螺桿菌（Helicobacter）的豐度，繼而可能有助于對(duì)抗尿酸酶缺失后的腸道損傷[15]。且KDY 大鼠腸液的尿酸水平遠(yuǎn)高于野生型SD 大鼠[12,15]，這種現(xiàn)象可能與高尿酸環(huán)境有利于乳酸菌屬生存有關(guān)。

總之，與野生型SD 大鼠相比，KDY 大鼠腸道和糞便菌群發(fā)生了較大變化，在腸道菌群多樣性有所減少的趨勢(shì)下整體增加了乳酸菌的豐度。