TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路對甲基苯丙胺依賴CPP 大鼠海馬的影響

張 園 ，朱婷娜 ，曹媛媛 ，劉鵬亮 ，王一航 ，吳亞梅 ，李利華 ，趙永娜 ，洪仕君

（1）昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室;2）法醫學院;3）國際教育學院，云南 昆明 650500）

甲基苯丙胺（methamphetamine，MA），屬于苯丙胺類興奮劑，可進入血腦屏障導致大腦的結構和功能的改變[1]，其濫用誘發大腦多個腦區發生不同程度的神經損傷，從而誘導中樞神經系統神經毒性的產生[2]。研究發現[3]MA 依賴引起的神經毒性損傷海馬腦區損傷有重要聯系。MA 誘導海馬神經毒性的產生與單胺類神經遞質釋放增加[4?5]、ROS 和NOS 的產生、大腦免疫細胞的激活、凋亡與自噬[6]和神經炎癥[7]等有關。Toll 樣受體（Toll like receptors，TLR），能夠調控免疫及炎癥反應[8]，主要在小膠質細胞中表達[9]。TLR4細胞內信號通路分為髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性和β 干擾素TIR 結構域銜接蛋白（TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）依賴性通路。在MyD88 依賴途徑中當外界因素觸發后，細胞表面的刺激信號通過TLR4-MyD88-TRAF6-IκBPIκB-NF-κB 分子傳遞到細胞核，從而調節相關炎癥因子的轉錄[10]。顱腦外傷可以誘導神經元凋亡和神經炎癥，從而導致嚴重的神經元損害和行為障礙[11]，其中TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路的激活是造成中樞神經系統損傷的關鍵原因。在體外實驗中脂多糖損傷的 BV2 小膠質細胞和神經炎癥損傷的原代皮層神經元中采用TLR4 抑制劑 TAK-242 所產生的抗神經炎癥作用主要是與TLR4 介導的 MyD88/NF-κB 信號通路的調節有關[12]。Li B 等[13]的體外實驗表明阻斷 TLR4 介導的信號轉導，TLR4/MyD88/NF-κB 和 MAPK 通路的激活便會受到影響，從而抑制 BV-2 小膠質細胞中脂多糖刺激所產生神經炎癥。TLR4/MyD88/NF-κB 作為一條經典的炎性通路，在MA 誘導的海馬神經炎癥中具有較大的研究價值。本研究旨在探究研究TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路對甲基苯丙胺CPP 大鼠海馬的影響，同時采用特異性抑制劑TAK-242 抑制TLR4，在改善MA 依賴海馬神經炎癥中的作用，為藥物干預甲基苯丙胺依賴提供新的科學證據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：健康雄性SD 大鼠40 只，選擇體重在180～200 g，購于昆明醫科大學實驗動物學中心[動物使用許可證編號：SCXK（滇）K2015-002]。

藥品試劑：實驗所用甲基苯丙胺，由云南省公安廳禁毒技術公安部重點實驗室合法提供，純度在98%以上。BestarTMqPCR RT Kit、熒光定量試劑盒（DBI Bioscience）；引物合成（擎科生物科技有限公司）；TLR4 受體抑制劑（TAK-242，A3850，Apexbio 公司MyD88 抗體（ab2064，Abcam 公司）；TRAF6 抗體（66494，Proteintech 公司）；IκB-α抗體（9242，CST 公司）；p-IκB-α 抗體（2859，CST 公司）；NF-κB p65 抗體（8142s，CST 公司）；p-NF-κB p65 抗體（sc-136548，Santa Cruz Biotechnology 公司）；TLR4 抗體（sc-293072，Santa Cruz Biotechnology 公司）；β-actin 抗體（ab6276，購自美國Abcam 公司）。

主要儀器：大鼠 CPP 實驗箱（XR-XT401，上海欣軟信息有限公司）；酶標儀（Touch 2，美國BioTek 公司）；普通PCR 儀、熒光定量 PCR 儀（T100TM Thermal Cycler、C1000 Touch TM Thermal Cycler，美國Bio-Rad 公司）；垂直電泳儀、半干轉膜儀（552BR、221BR，美國Bio-Rad 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及給藥健康雄性SD 大鼠40 只，隨機分配為4 組，包括生理鹽水組：腹腔注射（生理鹽水（10 mg/kg，qd，14 d）；MA 實驗組：給藥 MA（10 mg/kg，ip，qd，14 d），大鼠形成MA 依賴，CPP 模型建模成功；TAK-242 組：給藥 TAK-242（3 mg/kg，ip，qd，14 d）；MA+TAK-242 組：給藥 TAK-242（3 mg/kg，ip，qd，14 d）后1 h 給予 MA（10 mg/kg，ip，qd，14 d）。

1.2.2 條件性位置偏愛模型（CPP）連續3 d 將隨機分組的大鼠放入實驗檢測的黑白箱中以適應檢測環境，第4 天檢測每只大鼠的天然偏好時間；連續14 d 對大鼠以10 mg/kg 的MA 進行腹腔注射給藥，使得大鼠產生依賴，再進行CPP 檢測。

1.2.3 WesternBlot 實驗用 10%的水合氯醛，按0.3 m L/100 g 麻醉后迅速水合氯醛麻醉大鼠，用0.9%的氯化鈉注射液對大鼠心臟灌注，將腦血管中的血液沖洗干凈斷頭，取出全腦，分離大鼠海馬組織解剖大鼠，取大鼠海馬組織，勻漿，測定蛋白濃度。配制10%和12%的分離膠；上樣、電泳，轉膜、孵育一抗（β-actinantibody Anti-TLR4、Anti-Myd88、Anti-TRAF6、Anti-IκB-α、Anti-pIκB-α、Anti-NF-κBp65、Anti-P-NFκBp65 均按照1∶1000 配制），放入4 ℃過夜，1xTBST 漂洗3 次，溫室孵育二抗（2 h），再次漂洗，采用ECL 顯影。Image Pro Plus 圖像分析軟件分析目的條帶與對應內參（β-actin）條帶二者平均光密度比值，最后進行統計學分析。

1.2.4 熒光定量PCR 實驗取海馬組織80 mg，放入 EP 管中，勻漿，用酶標儀測定RNA 濃度；按照說明書逆轉錄合成cDNA；熒光實時定量PCR 儀，經94 ℃ 5 min 預變性、94 ℃變性、58 ℃退火、72 ℃延伸，此循環進行40 次，采用2－ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，熒光定量PCR 引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR 引物序列Tab.1 Fluorescence quantitative PCR primer sequence

1.3 統計學處理

采用 SPSS 19.0 進行數據分析，數值代表均數±標準差（）表示，用于統計分析的Prism軟件5.0 作圖（GraphPad software），組內給藥前后比較采用配對t檢驗；組間多組比較采用多因素方差分析（Multi-factor analysis of variance），多重比較方法采用 Tukey-HSD，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甲基苯丙胺依賴CPP 大鼠海馬中TLR4、MyD88、TRAF6、IκB-α、p-IκB-α、NFκBp65、p-NF-κBp65 蛋白表達

TLR4 蛋白變化：圖1A 結果顯示與生理鹽水組相比，MA 組TLR4 蛋白表達升高（P<0.01）；與MA 組相比，MA+TAK-242 組TLR4 的蛋白表達下降（P<0.01）。

MyD88 蛋白變化：圖1B 結果顯示與生理鹽水組相比，MA 組MyD88 蛋白表達升高（P<0.01）；與MA 組相比，MA+TAK-242 組MyD88 蛋白表達下降（P<0.01）。

TRAF6 蛋白變化：圖1C 結果顯示與生理鹽水組相比，MA 組TRAF6 的蛋白表達升高（P<0.01）；與MA 組相比，MA+TAK-242 組TRAF6的蛋白表達下降（P<0.01）。

圖1 大鼠海馬中TLR4/MyD88/NF-κB 信號轉導通路蛋白表達水平變化。Fig.1 The protein expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal transduction pathway in the hippocampus of rats

p-IκB-α 蛋白變化：圖1D 結果顯示與生理鹽水組相比，MA 組p-IκB-α 蛋白表達升高p-IκB-α 蛋白表達升高（P<0.05），與MA 組相比，MA+TAK-242 組p-IκB-α 蛋白表達下降（P<0.01）。

IκB-α 蛋白變化：圖1E 結果顯示與生理鹽水組相比，MA 組IκB-α 蛋白表達降低（P<0.01）；與MA 組相比，MA+TAK-242 組IκB-α蛋白表達升高（P<0.01）。

p-NF-κBp65 蛋白變化：圖1F 結果顯示與生理鹽水組相比，MA 組p-NF-κBp65 蛋白表達升高（P<0.05）；與MA 組相比，MA+TAK-242 組的p-NF-κBp65 蛋白表達下降（P<0.05）。

NF-κBp65 蛋白變化：圖1G 結果顯示與生理鹽水組相比，MA 組NF-κBp65 蛋白表達升高（P<0.01）；與MA 組相比，MA+TAK-242 組的NF-κBp65 蛋白表達下降（P<0.05）。

上述結果提示MA 可通過TLR4/MyD88/NFκB 信號通路誘導MA 依賴CPP 大鼠海馬發生神經炎癥。

2.2 甲基苯丙胺依賴CPP 大鼠海馬中TLR4、MyD88、TRAF6、IκB-α、NF-κBp65mRNA表達

TLR4 mRNA 表達變化見表2 和圖2A，結果顯示與生理鹽水組相比，MA 組TLR4mRNA 表達上升（P<0.01）；與MA 組相比，MA+TAK-242組TLR4mRNA 表達下降（P<0.01）。

圖2 大鼠海馬中TLR4/MyD88/NF-κB 信號轉導通路的mRNA 表達水平統計結果Fig.2 The mRNA expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal transduction pathway in the hippocampus

表2 大鼠海馬中TLR4/MyD88/NF-κB 信號轉導通路的mRNA 表達（n=6，）Tab.2 The mRNA expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal transduction pathway in the hippocampus of rats（n=6，）

表2 大鼠海馬中TLR4/MyD88/NF-κB 信號轉導通路的mRNA 表達（n=6，）Tab.2 The mRNA expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal transduction pathway in the hippocampus of rats（n=6，）

與對照組進行比較，**P < 0.01，***P < 0.001；與MA組進行比較，##P < 0.05 ，###P < 0.001。

MyD88 mRNA 表達變化：表2 和圖2B 結果顯示與生理鹽水組相比，MA 組MyD88mRNA 表達上升（P<0.01）；與M 組相比，MA+TAK-242組MyD88mRNA 表達下降（P<0.01）。

TRAF6 mRNA 表達變化：表2 和圖2C 結果顯示與生理鹽水組相比，MA 組TRAF6mRNA 表達上升（P<0.01），與MA 組相比，MA+TAK-242組TRAF6mRNA 表達下降（P<0.01）。

IκB-α mRNA 表達變化：表2 和圖2D 結果顯示與生理鹽水組相比，MA 組IκB-α mRNA表達下降（P<0.01），與MA 組相比，MA+TAK-242 組IκB-α mRNA 表達上升（P<0.01）。

NF-κBp65 mRNA 表達變化：表2 和圖2E結果顯示與生理鹽水組相比，MA 組NF-κBp65 mRNA 表達上升（P<0.001），與MA 組相比，MA+TAK-242 組NF-κBp65 mRNA 表達下降（P<0.001）。

3 討論

已有研究表明，MA 依賴誘導海馬神經炎癥，造成了神經系統的損害。炎性因子過渡累積就會對機體產生嚴重的危害，其中與損害最為嚴重的海馬腦區為例。本研究發現MA 依賴的CPP 大鼠激活了海馬腦區TLR4/MYD88/NF-κB 信號通路，誘導了海馬神經炎癥的發生。

TLR4 作為天然免疫識別受體，通過Myd88通路發揮作用[14，15]。本研究表明：與對照組相比，MA 組TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白和mRNA 表達均增加。Xie 等[16]的研究發現，在MA 中毒大鼠模型中，MA 可使大鼠紋狀體中 TLR4，MyD88，TRAF6 蛋白表達增加；Du 等的研究在 MA 中毒小鼠模型中，MA 也可使中腦和紋狀體中TLR4蛋白表達增加[8,17]，上述結果均與與本研究結果一致，但是本研究對于海馬腦區的檢測不僅包含上述因子蛋白水平的變化，還在mRNA 水平進一步驗證了MA 依賴可通過激活TLR4/MyD88 信號通路，誘導海馬神經炎癥發生。Qing-Peng Hu 等[18]的研究表明，組蛋白乙?；{節抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACI）可抑制TLR4/MYD88信號通路中TLR4 的表達，從而抑制小膠質細胞激活和神經元凋亡，這就表明阻斷TLR4 對神經炎癥誘導的腦損傷具有潛在的神經保護作用。本研究采用TLR4 受體抑制劑TAK-242 預處理，特異性地抑制了海馬腦區TLR4 的表達，減少了MyD88、TRAF6 的蛋白及mRNA 的表達。

研究發現多種分子機制可以介導炎癥過程，其中最顯著的機制是通過核因子NF-κB 信號通路[19]，磷酸化的NF-κB 抑制因子（inhibitor of NFκB，IκB），使IKB 降解，進而激活NF-κB，其中p65 是NF-κB 的主要活性亞單位[20]。本研究采用Western blot 檢測MA 依賴CPP 大鼠海馬中p-IκB-α、NF-κBp65、p-NF-κBp65 蛋白表達均增加，IκB-α 的蛋白表達下降。Liu X 等發現[21]，苦碟子注射液（KDZ）可通過下調TLR4依賴性 NF-κB 信號通路，降低TRAF6、NFκBp65 和p-IκBα/IκBα 的蛋白表達，保護大腦免受缺血性損傷。Long H 等也發現[22]，在大鼠Tourette 綜合征（TS）模型中，TS 大鼠紋狀體中IκB-α 蛋白表達降低，p-IκB-α 蛋白表達升高，結果均與本研究一致。不同的是本研究采用特異性TLR4 拮抗劑TAK-242 預處理后，p-IκBα、NF-κBp65、p-NF-κBp65 蛋白表達降低，IκB-α 蛋白表達增加。此外，本研究發現IκBαmRNA 表達降低、NF-κBp65 mRNA 表達增加，結果與蛋白水平一致。采用TLR4 受體抑制劑（TAK-242）預處理，特異性地抑制了海馬腦區TLR4 的表達，減少了的NF-κB 通路關鍵蛋白及mRNA 的表達，從而減輕MA 依賴大鼠海馬腦區的神經炎癥。

綜上所述，TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路參與了MA 依賴大鼠CPP 效應的形成，該信號通路的激活可以誘導MA 依賴大鼠海馬神經炎癥的發生。采用特異性的TLR4 抑制劑可以改變TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路相關的因子的表達，減輕MA 依賴的海馬神經炎癥。