基因編輯技術在現代醫學中的應用與挑戰

李香靈，崔安芳，黃延紅，馬曉磊

（濟寧醫學院，山東濟寧 272067）

基因的突變和缺失會干擾正常的代謝途徑、細胞周期調節和配體/受體功能，導致許多疾病的發展，而基因編輯技術的出現為這些疾病提供了一種新的解決方案[1]。在臨床上，基因編輯技術已經用于糾正和治療一些遺傳性疾病，如地中海貧血[2]、高膽固醇血癥[3]、先天性黑蒙癥[4]等，還可以用于治療艾滋病、癌癥和阿爾茨海默病等后天性疾病[5-6]。但基因編輯技術的臨床轉化和大規模應用仍處于初級階段。RNAi 和CRISPR-Cas9 系統是近年來最具代表性的基因編輯技術。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）可以在信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）水平上抑制基因表達，而規律間隔成簇短回文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）和其相關蛋白（CRISPR-associated protein，Cas）可以方便、高效和精確地切割靶位點的DNA 雙鏈[7]。本文將對RNAi 和CRISPR-Cas9 系統的基因編輯機制進行概述，并介紹RNAi 和CRISPRCas9 在現代醫學中的相關應用和面臨的挑戰。

1 RNA 干擾技術

1.1 原理與機制

RNAi 是一種轉錄后基因調控機制，可以由小干擾RNA（siRNA）、短發夾RNA（shRNA）、微小RNA（miRNA）以及其他非編碼RNA（如piRNA）觸發[8]。雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）可以通過這種機制誘導mRNA的序列特異性降解或抑制mRNA的功能[9]。如圖1 所示，核糖核酸內切酶Dicer 通過切割較長的dsRNA 或shRNA 產生擁有21 ～23 個堿基的成熟的siRNA[10]。經加工后，成熟的siRNA 被整合到包括Dicer 和Ago-2 在內的RNA 誘導沉默復合物（RNA-Induced Silencing Complex，RISC）中[11]。隨后siRNA 在RISC 中被分離成正義鏈和反義鏈，正義鏈被釋放，而反義鏈被保留下來通過與靶標的互補結合觸發靶標序列被Ago-2 內切酶切割[12]。臨床治療中，可以通過直接給予人工制備的siRNA 來繞過Dicer 介導的形成成熟siRNA 的初始步驟。

圖1 siRNA 作用機制示意圖

1.2 應用領域

自2018 年第一款siRNA 藥物上市以來，目前已有5 種siRNA 藥 物（patisiran、givosiran、lumasiran、inclisiran 和vutrisiran）獲批[3,13-16]，還有58 種siRNA藥物處于臨床階段。siRNA 在癌癥治療和抗病毒等領域同樣進展迅速，包括脂質體、脂質納米粒和抗體在內的各種載體已被用于體內外傳遞siRNA[17-18]。

1.2.1 癌癥治療

與化療等傳統方法相比，siRNA 介導的抗癌治療有以下優點[19]：（1）特異性高，副作用小；（2）通過級聯放大作用進一步沉默靶mRNA；（3）可以同時抑制多個腫瘤基因；（4）易于合成，生產成本低。

目前已有多種siRNA 抗癌藥物進入臨床。Atu027是一種被包裹在脂質納米顆粒中的siRNA，靶向致癌基因蛋白激酶N3（Protein Kinase N3，PKN3），臨床試驗（NCT00938574）顯示其聯合吉西他濱對晚期或轉移性胰腺癌患者有良好的活性和安全性[20-21]。siG12D LODER 是一種局部長效siRNA 遞送系統，靶向突變的大鼠肉瘤（RAS）蛋白，I 期臨床研究顯示其在胰腺癌患者中有良好安全性和有效性[22]。APN-401 可以減少自體外周血單核細胞中E3 泛素連接酶（Casitas B-lineage lymphoma proto-oncogene b，Cbl-b）的表達來增強免疫反應，I 期臨床研究顯示其在癌癥患者中誘導了長期的疾病穩定[23]。

1.2.2 抗病毒

siRNA 能以高特異性和低毒性的特征沉默靶基因，并且由于siRNA 序列能被快速設計并合成，使其能適應病毒的各種突變。

早期的RNAi 療法使用單個siRNA 序列治療病毒感染。例如，ALN-RSV01 是一種靶向呼吸道合胞體病毒非結構核衣殼蛋白mRNA 的單一siRNA，目前已成功進入Ⅱb 期臨床試驗[24]。最近的RNAi 療法通過使用多個siRNA 序列來克服病毒的高突變率，防止由于單個靶點突變而引起藥物失效[18]。例如，TKM-130803 由兩種等比例的siRNA 分子組成，以脂質納米顆粒為載體，通過同時靶向病毒的siLpol-2 RNA 和siVP35-2 RNA 抑制埃博拉病毒復制[25]。TENG 等[26]報道了靶向波恩病毒的TD-Borna 混合物，通過同時靶向病毒包殼必需的N-mRNA 和病毒RNA 合成必需的L-mRNA 來抑制病毒。

2 CRISPR-Cas9 系統

2.1 原理與機制

CRISPR 系統由單引導RNA（single guide RNA，sgRNA）和DNA 內切酶Cas 蛋白組成，可以在基因組的目標位置引入平末端雙鏈斷裂（Double-Stranded Breaks，DSBs）[27]。如圖2 所示，CRISPR-Cas9 復合物通過尋找原間隔相鄰基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）與DNA 鏈接觸，隨后CRISPR-Cas9 復合物解開PAM 序列附近的前10 ～12 個核苷酸[28-29]。如果sgRNA 的前8 ～12 個核苷酸與DNA 發生互補結合，則Cas9 中的HNH 核酸酶結構域和RuvC 結構域會分別切割初級DNA 鏈和次級DNA 鏈[30]修復DSBs有兩種高度保守的機制：非同源末端連接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）途徑和同源定向修復（Homology-Directed Repair，HDR）途徑[31]。通過NHEJ 修復的DNA 通常導致基因被破壞，常用于減少致病基因的過度表達。相反，HDR 可以在存在修復模板的情況下觸發，并用于有意糾正基因突變或插入合成序列[32]。

圖2 CRISPR-Cas9 系統作用機制示意圖

2.2 應用領域

目前進入臨床的CRISPR-Cas9 療法的適應癥包括各種遺傳疾病。例如，Exagamglogene Autotemcel通過靶向血紅蛋白來改善地中海貧血，目前已經申請上市[2]。AGN-151587 通過調節Cep290 基因治療先天性黑蒙癥，目前處于臨床Ⅱ期[4]。同時CRISPRCas9 系統在癌癥、病毒感染等領域的研究也發展迅速[33]。絕大多數CRISPR-Cas9 臨床試驗都從患者身上提取特定細胞，進行富集和基因編輯，然后重新引入患者體內，這有助于提高基因編輯效率并降低藥物毒性。除了離體方法，CRISPR-Cas9 也可以通過載體進行體內基因編輯。

2.2.1 癌癥

CRISPR-Cas9 技術在癌癥治療中的應用，一方面是產生嵌合抗原受體T（Chimeric Antigen Receptor-T，CAR-T）細胞，通過收集患者T 細胞并進行CRISPRCas9 基因編輯，達到在體外攻擊癌癥抗原的目的，然后將這些細胞轉移回患者體內。OTTAVIANO 等[34]使用CRISPR-Cas9 系統敲除了CAR19 T 細胞的T 細胞受體α 恒定區（T Cell Receptor Alpha Constant，TRAC）和分化簇52（Cluster of Differentiation 52，CD52），在I 期臨床實驗中對兒童B 細胞急性淋巴細胞白血病有一定療效。GIUFFRIDA 等[35]報道了CRISPRCas9 介導的腺苷2A 受體缺失增強了嵌合抗原受體T 細 胞（Chimeric AntigenReceptor T-cell，CAR-T細胞）效應功能，在臨床前模型中顯示出良好的療效。另一方面，CRISPR-Cas9 也可用于取代主要組織相容性復合體（Major Histocompatibility Complex，MHC）等位基因。MEISSNER 等[36-37]使用CRISPRCas9 敲除CD4+T 細胞中的β2-微球蛋白（beta-2-microglobulin，B2M）基因，導致MHC-I 表面表達喪失，從而產生大量可轉移的T 細胞，顯示出強大的抗白血病功能。CROWTHER 等[38]通過CRISPR-Cas9 系統敲除MHC-I 類相關蛋白MR1，確認其在多種癌癥上表達，并可以被T 細胞靶向，為癌癥治療提供新的思路。CRISPR-Cas9 還可以編輯干細胞和免疫應答細胞中的基因。例如，程序性死亡受體1（Programmed Cell Death Protein 1，PD-1）可以被CRISPR-Cas9 技術靶向并敲除，該技術對肝癌（NCT04417764）、肺癌（NCT02793856）和前列腺癌癥（NCT03525652）的臨床試驗正在進行中[39]。

2.2.2 抗病毒

CRISPR-Cas9 系統可以特異性靶向和破壞病毒的基因。TIAN 等[40]計劃通過CRISPR-Cas9 敲除HPV病毒E6 和E7 基因來治療HPV 相關的宮頸上皮內瘤變（NCT03057912）。SEEGER 等[41]證明CRISPR-Cas9系統可以特異性地破壞乙型肝炎病毒中的共價閉合環形DNA（covalenr closed circular DNA，cccDNA）以達到治療效果。WANG 等[42]證明CRISPR-Cas9 可以抑制人類皰疹病毒4 型（Epstein-Barr virus，EBV）基因的表達，通過在病毒感染的潛伏期精確靶向病毒基因組來減少感染。WOLLEBO 等[43]證明通過CRISPRCas9 可以在轉化的人類神經膠質細胞中滅活編碼T抗原的基因并抑制多瘤病毒JC 的復制。

3 RNAi 與CRISPR-Cas9 系統的應用挑戰

盡管RNAi 和CRISPR-Cas9 相關療法的開發在過去十年中進展迅速，但組織靶向遞送困難和脫靶效應仍較大地限制了其臨床應用，因此提高藥物傳遞效率和特異性是未來主要的研究方向。

3.1 傳遞效率

裸露或未修飾的siRNA 以及CRISPR-Cas9 系統容易被人體各種酶降解，導致傳遞效率低下，因此需要尋找高效的載體。納米載體是遞送siRNA 的常用載體，可以保護siRNA 免受核酸酶降解，促進細胞對siRNA 的攝取。但納米顆粒的穩定性差，并且在腫瘤組織中分布不均勻。病毒載體（例如腺病毒）是遞送CRISPR-Cas9 最全面的載體，具有致癌風險低、免疫原性低等優勢，但可能會增加藥物脫靶效應[44]。而非病毒遞送（如納米顆粒）可以更精確地控制給藥的劑量和時間，降低脫靶效應和潛在副作用，但也存在整體尺寸大導致遞送困難，編輯效率低等問題[46]。因此研究人員需要尋找適合的遞送系統，以提高基因編輯工具的傳遞效率。

3.2 特異性

RNAi 與CRISPR-Cas9 系統的另一個挑戰是特異性。siRNA 分子可能發生脫靶沉默，從而導致基因發生有害突變。研究表明，脫靶沉默的原因是siRNA有6 ～7 個核苷酸與脫靶基因存在同源性[46-47]。而CRISPR-Cas9 技術經常在不需要的基因組位點造成片段基因的插入或缺失，導致基因突變并產生毒性。KLEINSTIVER 等[48]的研究表明，可以通過修飾Cas9蛋白以改變候選識別位點的毗鄰基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）偏好或增強對靶DNA 的識別，這可以降低脫靶效應的頻率，如有研究人員通過設計新Cas 酶來優化基因編輯特異性[49-51]。

4 展望

RNAi 作為一種精確調控基因表達的工具，可以實現特定基因沉默，在基因治療、癌癥治療、遺傳病治療等領域具有廣泛的應用。然而，RNAi 仍面臨傳遞效率和特異性的挑戰，需要開發更有效的遞送系統和更穩定的RNA 分子，以提高傳遞效率和特異性。CRISPR-Cas9 系統為編輯基因組提供了強大的工具，并在基因功能研究和疾病治療中展示出巨大的應用前景。然而，CRISPRCas9 系統精確性和安全性需要進一步改進和評估，以減少非特異性基因編輯和潛在的副作用。

RNAi 和CRISPR-Cas9 系統在醫學研究和臨床實踐中的應用領域需要進一步拓展。除了目前研究較多的抗癌和抗病毒領域，未來的研究可以探索這些技術在神經退行性疾病、免疫系統疾病、傳染病等更多領域的潛在應用。此外，結合RNAi 和CRISPR-Cas9系統，可以開發出更多種類的組合治療策略，以提高療效并克服單一療法的局限性。