外泌體作為核酸載體在癌癥治療中的研究進展

董然然

（濮陽醫學高等專科學校，河南濮陽 457000）

關鍵字：外泌體；核酸；載體；癌癥

癌癥仍然是全球主要的死亡原因之一，每年有4.1 億例死亡病例[1]。癌癥的各種治療方法，如手術治療、化療和放療等雖然能降低癌癥死亡率，但這些方法副作用大，可能出現諸如高復發率、巨大的創傷、低生存率生活質量受損等各種問題[1]。因此，迫切需要開發安全和有效癌癥的技術。

基因治療是將治療性遺傳物質傳遞入細胞，通過轉化產生缺陷蛋白質基因或引入基因來補償異常基因，是一種安全、有效的治療各種疾病的方法?；蛑委煹男ЧQ于核酸藥物的靶向性、給藥時間和給藥工具的準確性。核酸包括特異性DNA、信使RNA（mRNA）、microRNA（miRNA）、小干擾RNA（siRNA）和環狀RNA（circRNA）[2]，廣泛應用于基因治療。然而，核酸帶負電荷且親水，不能直接穿透細胞膜，容易被酶降解，不能單獨轉運到細胞，因此需要開發合適的運載介質。外泌體是由不同細胞釋放到細胞外基質的小膜性囊泡，大小為40 ～150 nm，可以參與通信[3]。由于其在納米維度，外泌體被認為是最有前途的藥物傳遞工具。本文介紹了外泌體的特點，重點介紹了其作為DNA、信使RNA（mRNA）、microRNA（miRNA）、小干擾RNA（siRNA）、環狀RNA（circRNA）等核酸的傳遞載體的應用。同時，介紹并討論了它們在癌癥治療和外泌體臨床試驗中的應用。系統總結和分析了外泌體介導的核酸傳遞用于癌癥治療的研究進展和挑戰，為核酸藥物的開發提供理論依據。

1 外泌體作為核酸載體的優勢

與傳統的脂質納米顆粒（LNPs）等遞送系統相比，外泌體具有以下優點[4]：（1）外泌體在體液中比LNPs 更穩定；（2）外泌體由于其內源性來源和較高的生物相容性，具有相對較低的細胞毒性和免疫原性；（3）外泌體在給藥過程中可以提供更好的藥物保護，因為藥物在雙層外泌體膜內，比位于LNPs 外的藥物穩定性更好；（4）外泌體可以傳遞疏水分子和親水分子，對腫瘤部位高效的歸巢能力可能是因為它們對細胞來源的表面部分的多價顯示；（5）來自腫瘤的外泌體通過與外泌體表面的CD47 和巨噬細胞表面的信號調節蛋白alpha（SIRPα）結合，逃脫單核吞噬系統的吞噬；（6）外泌體由于其體積小的特點，可以穿過血腦屏障到達腦組織；（7）外泌體具有較高的細胞攝取能力，由于四酯蛋白和纖維連接蛋白等膜蛋白，很容易根據靶細胞進行修飾。

2 基于外泌體的核酸傳遞系統在癌癥治療中的應用

2.1 治療性DNA 的傳遞

外泌體通過內吞作用將各種功能化的DNA 注入細胞，以治療癌癥。然而，由于其尺寸小，通過外泌體包裝大DNA 的效率非常低，這限制了基于外泌體的藥物傳遞系統的應用。有研究表明[5]，使用相對較小的反義寡核苷酸（ASO）和質粒DNA，或工程修飾的外泌體可以解決這個問題。Codiak 生物科學公司[6]發表了工程外泌體傳遞ASO（exoASO）的臨床前數據，表明exoASO 向M2 巨噬細胞靶向關鍵免疫抑制轉錄因子信號轉導與轉錄激活因子6（STAT6）和CCAAT/增強子結合蛋白（C/EBP）表達的潛力。結果顯示，與exoASO治療相關的TNF 和IL-10 的表達分別增加了40 倍和29 倍，這與免疫抑制M2 巨噬細胞向免疫刺激M1巨噬細胞的復極化相一致，而exoASO-STAT6 顯著減緩了腫瘤生長，50%的小鼠腫瘤完全消退。當exoASO-STAT6 與抗程序性死亡受體-1（PD-1）抗體聯合使用時，腫瘤緩解率進一步提高了25%。

此外，隨著CRISPR/cas9 介導的基因組編輯技術的興起，人們也在嘗試通過外泌體傳遞cas9 編碼質粒。例如，KIM 等[7]報道，卵巢癌來源的外泌體（SKOV3-Exo）可以在體內通過電穿孔方式有效傳遞CRISPR/Cas9 質粒，以抑制多聚ADP-核糖聚合酶1（PARP-1）的表達。與單獨使用SKOV3-Exo 相比，CRISPR/cas9 負載SKOV3-Exo 治療后PARP-1 的表達被完全抑制，腫瘤內注射治療20 d 內，治療組的腫瘤體積幾乎沒有變化，而對照組的腫瘤體積保持增長。

2.2 治療性mRNA 的傳遞

mRNA 被核酸酶降解，從而激活免疫反應，這已成為mRNA 藥物開發的主要障礙。外泌體作為一種天然的傳遞載體，可以實現mRNA 的有效傳遞。WANG 等[8]應用外泌體將編碼HChrR6 的mRNA（通過轉染XPort/HChrR6 編碼質粒產生）傳遞到HER2+ve 人乳腺癌細胞，導致乳腺癌細胞生長停滯。YANG 等[9]報道了一種細胞納米穿孔技術，用于生產大量含有治療性mRNA 外泌體，在此基礎上，磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）CDX（CD47 克隆目標肽）質粒轉移到膠質瘤細胞獲得大量的目標功能性外泌體，增強細胞攝取，恢復PTEN 蛋白的表達，抑制腫瘤生長。表明外泌體介導的mRNA 傳遞在癌癥治療中具有很好的潛力。

2.3 治療性miRNA 的傳遞

MicroRNA（miRNA）是一種可以調控基因表達的非編碼RNA。某些miRNA 的異常表達會影響疾病的進展，如腫瘤?；謴瓦@些miRNA 的表達可以抑制腫瘤的進展，這為腫瘤治療提供了一種新的方法。然而，miRNA 在體內很容易被降解，通過外泌體傳遞可以避免這一問題。

KATAKOWSKI 等[10]報道，外泌體轉移miRNA-146b（miR-146b）可以通過靶向表皮生長因子受體（EGFR）抑制膠質瘤細胞增殖，腫瘤內注射外泌體miR-146b 顯著降低大鼠模型中膠質瘤異種移植物的生長。此外，外泌體miRNA 抑制劑的傳遞，干擾腫瘤促進的miRNA，可以抑制腫瘤的生長或轉移。ZENG 等[11]發現，高水平的血清外泌體miR253p 與結腸直腸癌（CRC）轉移相關。CRC 細胞外泌體miR253p 可通過靶向肺Krüppel 樣轉錄因子（KLF2 和KLF4），促進CRC 誘導的血管通透性和血管生成，從而促進CRC轉移。這些研究表明，利用外泌體平衡這些miRNA的表達水平在腫瘤治療中具有重要意義。

2.4 治療性siRNA 的傳遞

癌癥進展與抗凋亡蛋白[如B 細胞淋巴瘤/白血病-2（BCL-2）、Polo 樣激酶1（PLK1）、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）]、啟動細胞有絲分裂的生存蛋白和細胞生長因子的上調有關[12]。靶向腫瘤細胞的siRNA 外泌體治療已被認為可下調這些致癌基因的表達，以抑制細胞的增殖和遷移。KABAN 等[12]將BCL-2 siRNA 裝入自然殺傷（NK）細胞來源的外泌體中，治療ER+乳腺癌，導致乳腺癌細胞凋亡增強。表明外泌體介導的siRNA 傳遞可以有效地抑制癌細胞的增殖和遷移。

然而，耐藥性是癌癥治療中的另一個主要挑戰。一般來說，化療耐藥相關蛋白的過表達導致癌細胞耐藥，利用siRNA克服耐藥性已被廣泛報道[13]。LIN等[14]利用iRGD 環肽修飾的外泌體特異性地將（siCPT1A）傳遞到結腸癌細胞中，以抑制脂肪酸的氧化作用缺陷（FAO），逆轉了耐藥結腸癌細胞對奧沙利鉑的敏感性。上述方法可有效減輕癌細胞的耐藥性，為腫瘤治療提供新的思路。

2.5 治療性環狀RNA 的傳遞

外泌體自然攜帶的環狀RNA 已被廣泛開發用于癌癥治療，由于其遞送效率，大大提高了治療效果。然而，外泌體修飾的外源性環狀RNA 的傳遞也面臨著一些挑戰：環狀RNA 的特殊結構導致了較少的環狀結構[15]；大分子環狀RNA 也面臨著與上面討論的大尺寸mRNA相同的問題，它不需要加載到外泌體中。為了解決這些問題，YANG 等[16]將靶circRNA_DYM編碼DNA 構建到慢病毒表達載體中，然后將RVGLamp2b 質粒轉染到HEK293T 細胞中，分泌穩定過表達靶circRNA_DYM 的基因外泌體（RVG-circDYMEX）。它不僅可以使環狀RNA 正確、有效地環化，還可以很容易地裝載到外泌體中。RVG-circDYMEX 通過結合TATA-box 結合蛋白相關因子1（TAF1）并下調多個下游基因（TRPM6，Cyp39al），以減輕慢性不可預測應激引起的星形膠質細胞功能障礙。circRNA 的環狀結構不僅可以防止被降解，提高circRNA 的表達時間和表達量，而且可以反復給藥，使其成為新興的核酸藥物之一。

3 外泌體的批量生產

雖然相關理論已經取得了重大的進展，但為臨床試驗大規模生產外泌體仍存在一定的困難，目前已經開發了生物反應器、3D 裂模和微融合裝置等設備。例如，HARASZTI 等[17]應用3D 培養結合切向弓狀生長法（TFF），與2D 或3D 培養或TFF 相比，外泌體的產量增加了140 倍。另一項研究發現[18]，使用中空FBER 生物反應器可以將外泌體的產量提高40 倍。WANG 等[19]報道，3D 納米結構微融合芯片可以捕獲90%的外泌體。此外，一些研究表明[20]，應激環境，如缺氧、低pH 值和抗癌藥物，可以刺激更多的外泌體的產生。

4 結語

與傳統的納米載體相比，外泌體具有較低的免疫原性、較低的毒性和更好的跨越生物屏障的能力。基于這些優點，外泌體在核酸傳遞方面顯示出了巨大的價值，并可以保護治療物質不被宿主免疫系統降解和清除。此外，其親本細胞固有的靶向能力使外泌體具有靶向傳遞的潛力，增強了穿透腫瘤血管屏障和腫瘤部位生物積累的能力，大大提高了其治療能力。以外泌體為基礎的傳遞系統在癌癥治療方面具有獨特的優勢。但目前的外泌體-核酸裝載策略的低負載率，包括電穿孔、孵育和轉染，限制了其應用。另外，外泌體的異質性和復雜的體內環境限制了精確的傳遞和預期的表達，實現癌癥的個性化精確治療也是未來的一個研究方向。