間充質(zhì)干細(xì)胞在骨發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制

鄧力，傅蓉

（中國藥科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇南京 211198）

骨是一種堅(jiān)硬并具有一定彈性的結(jié)締組織，全身骨互相連接構(gòu)成骨骼[1]。骨的主要功能有保護(hù)內(nèi)臟、支撐機(jī)體、造血、提供肌肉附著位點(diǎn)以及儲存某些礦物質(zhì)[2]。構(gòu)成骨骼系統(tǒng)的細(xì)胞多數(shù)由間充質(zhì)干細(xì)胞分化，并形成完整的骨細(xì)胞譜系，包括軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞與成脂細(xì)胞[3]，而破骨細(xì)胞一般起源于淋巴細(xì)胞系[4-5]。組織中各細(xì)胞的數(shù)量、細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)及胞間基質(zhì)共同影響著骨骼生物學(xué)功能完整性，其中存在著較為復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制。骨疾病中先天骨畸形、骨折、骨質(zhì)疏松和骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展與間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)作用有關(guān)，隨著對間充質(zhì)干細(xì)胞的深入研究，相關(guān)疾病的治療手段也不斷被推向新的方向。本文主要對間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)概念、骨形成的基本過程及相關(guān)信號通路進(jìn)行綜述，并對間充質(zhì)干細(xì)胞在骨修復(fù)領(lǐng)域的研究情況進(jìn)行簡要介紹。

1 骨的形成

有關(guān)節(jié)的骨骼出現(xiàn)在4 億年前的寒武紀(jì)多骨魚類中。在現(xiàn)代哺乳動物中，中軸骨包括頭骨、中耳聽骨、舌骨、肋骨、胸骨和椎骨，附件骨骼包括骨盆、胸帶以及四肢的骨骼。所有的骨骼都是在發(fā)育過程中由神經(jīng)嵴、軸旁中胚層和側(cè)板中胚層3個(gè)胚胎譜系形成的。在胚胎早期，骨骼的形成已經(jīng)開始，骨骼的初始形態(tài)由胚胎的軟骨和結(jié)締組織構(gòu)成，并開始骨化。骨化是指骨組織的生成過程中，成骨細(xì)胞在骨基質(zhì)中發(fā)生鈣質(zhì)沉積，骨化有膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨兩種類型[6]。

1.1 膜內(nèi)成骨

膜內(nèi)成骨常見于一些扁骨，如顱蓋骨、面顱骨等[6]。在膜內(nèi)成骨過程中，源自神經(jīng)嵴與軸旁中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞首先聚集成片狀，之后直接分化為成骨細(xì)胞，并產(chǎn)生礦化組織。

1.2 軟骨內(nèi)成骨

軟骨內(nèi)成骨則是更為普遍的骨骼形成方式，這一成骨方式首先發(fā)生間充質(zhì)干細(xì)胞凝聚，之后部分間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，分化后的細(xì)胞不斷分泌軟骨基質(zhì)，形成透明軟骨[6-7]。完整的軟骨中只有覆蓋軟骨表面的軟骨膜含有血管，而透明軟骨內(nèi)并不含有血管，其營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的運(yùn)輸均通過擴(kuò)散作用在基質(zhì)中進(jìn)行交換[8]。軟骨內(nèi)骨中的礦化骨替代軟骨是一個(gè)復(fù)雜的過程，軟骨細(xì)胞不斷分泌基質(zhì)，導(dǎo)致軟骨體積增大，此時(shí)處于軟骨原中心位置增殖的軟骨細(xì)胞則有了進(jìn)一步分化為肥大軟骨細(xì)胞的趨勢并逐漸退出細(xì)胞增殖周期[6-9]。隨后成骨前體細(xì)胞、破骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞從軟骨膜侵入肥大的軟骨。肥大的軟骨被吸收，傳入的成骨前體細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞并形成骨小梁，造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在這一主要的成骨中心構(gòu)建骨髓，這一空間又稱為初級骨化中心[7,9-10]。軟骨膜中的成骨前體細(xì)胞同樣分化為成骨細(xì)胞，在原軟骨基質(zhì)周圍沉積皮質(zhì)骨（密質(zhì)骨）。另外，隨著生物體的成長，初級骨化中心擴(kuò)大，在發(fā)育中的骨骼的一端或兩端將形成次級骨化中心[11]。

骨骼一旦形成，都會經(jīng)歷持續(xù)性的重塑，主要由機(jī)械傳導(dǎo)信號決定。因此，所有在發(fā)育中的骨、新形成的骨或是再生的骨組織，都會基于施加在它身上的力量不斷地被吸收和改造。這些過程要是為了賦予骨質(zhì)結(jié)構(gòu)最佳的強(qiáng)度和功能，但該重塑同樣可因過度吸收導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能的喪失而對骨骼的再生過程或移植過程產(chǎn)生重大影響[12]。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞

二十世紀(jì)六七十年代，F(xiàn)RIEDENSTEIN 團(tuán)隊(duì)[13-16]發(fā)現(xiàn)并定義了一類骨髓細(xì)胞的亞群，由于其形態(tài)與成纖維細(xì)胞十分相似，故最開始稱為“貼壁集落形成單位-成纖維細(xì)胞群（adherent Colony-Forming Unit Fibroblasts，CFU-Fs）”，區(qū)別于非貼壁造血系集落形成單位細(xì)胞群（non-adherent hematopoietic CFU cells）。該細(xì)胞群最初被認(rèn)為與骨骼形成有關(guān)，即可產(chǎn)生與骨骼組織相關(guān)的細(xì)胞，屬于一類祖細(xì)胞或干細(xì)胞。此外，OWEN 等[17-18]認(rèn)為該類細(xì)胞在體外培養(yǎng)造血干細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞時(shí)，還充當(dāng)著飼養(yǎng)細(xì)胞的角色。隨著對CFU-Fs 生物學(xué)功能研究的完善，CFU-Fs 的名稱也被改為更能體現(xiàn)出其作用的“成骨干細(xì)胞”或“骨髓基質(zhì)細(xì)胞”。之后，DING 等[19]重新將該類細(xì)胞描述為中胚層中的多能祖細(xì)胞，認(rèn)為其后代最終會產(chǎn)生骨骼組織，包括軟骨、骨、肌腱、韌帶、骨髓基質(zhì)及結(jié)締組織，并由此將該類細(xì)胞定義為現(xiàn)在通用名稱——間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）。

一般認(rèn)為，尚在培養(yǎng)中的間充質(zhì)干細(xì)胞包含幾種不同的亞群，并且不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞不完全相同。由于在不同研究過程中，科研人員使用了不同的細(xì)胞分離、擴(kuò)增及鑒定方法，而且間充質(zhì)干細(xì)胞并無單一的表面分子用以識別，導(dǎo)致研究人員對間充質(zhì)干細(xì)胞的研究結(jié)果進(jìn)行對比時(shí)存在一定的困難。為了解決這一問題，國際細(xì)胞治療協(xié)會提出并定義了人類間充質(zhì)干細(xì)胞的最低認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)[20]：（1）在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下維持的間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)具有對塑料的黏附性；（2）間充質(zhì)干細(xì)胞需表達(dá)分化簇（CD），包括CD105、CD73 和CD90 等表面抗原，缺乏CD45、CD34、CD14 或CD11b、CD79α 或CD19 及 人 類 白細(xì)胞抗原-DR（HLA-DR）等表面分子；（3）細(xì)胞應(yīng)具備在標(biāo)準(zhǔn)體外分化條件下分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的潛能。

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的分化

間充質(zhì)干細(xì)胞在體外具有增殖能力，形態(tài)為紡錘形，近似于成纖維細(xì)胞[21]。在低水平Wnt/β-catenin的信號水平下，間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖將受到限制[22]。其增殖能力也會隨培養(yǎng)時(shí)間和傳代次數(shù)的增加而下降，這一改變體現(xiàn)在端粒酶活性的下降與細(xì)胞形態(tài)的改變[23]。此外，低氧環(huán)境可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，這與該細(xì)胞在體內(nèi)所處的環(huán)境較為相似，該現(xiàn)象與線粒體在正常氧環(huán)境下的氧化損傷密切相關(guān)[24-25]。

間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞是由Wnt/β-catenin、轉(zhuǎn)化生長因子家族（TGF-βs）、刺猬蛋白家族（HH）、骨形態(tài)生成蛋白家族（BMPs）和成纖維細(xì)胞生長因子家族（FGFs）等上游信號分子通路調(diào)節(jié)的，以上通路的激活共同引導(dǎo)了Y 染色體盒（SOX）家族發(fā)揮適當(dāng)?shù)淖饔茫⊿OX5 和SOX6，特別是其中的SOX9，它們將持續(xù)引導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化至肥大狀態(tài)，對于整個(gè)軟骨組織的生成是非常必要的[26-29]。在軟骨細(xì)胞分化的過程中，其基質(zhì)將會逐漸累積某些硫酸化糖蛋白，如聚集蛋白聚糖（Aggrecan）以及Ⅱ型膠原蛋白（Type Ⅱ Collagen），形成獨(dú)特的軟骨集落。體外軟骨生成通常是將原代間充質(zhì)干細(xì)胞聚集培養(yǎng)，后用轉(zhuǎn)化生長因子-β1 或-β3（TGF-β1 或β3）、胰島素樣生長因子1（IGF-1）、成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF-2）或骨形態(tài)生成蛋白2（BMP-2）進(jìn)行刺激[30-33]。

間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化同樣包含多種信號途徑，這一生物學(xué)進(jìn)程則主要取決于成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（SP7/Osterix）、runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）等轉(zhuǎn)錄因子的作用[34-35]。其中，RUNX2 的作用是改變轉(zhuǎn)錄以利于骨相關(guān)基因的表達(dá)，如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)器GLUT1，它的上調(diào)有利于細(xì)胞對葡萄糖的攝取增加。成骨細(xì)胞的分化需要大量的能量，RUNX2 的表達(dá)先于GLUT1 的上調(diào)，由于GLUT1 的上調(diào)，葡萄糖的運(yùn)輸和攝取增加，從而滿足細(xì)胞分化所需能量[36-37]。這一轉(zhuǎn)錄因子同時(shí)受上游途徑的調(diào)節(jié)，特別是Wnt/β-catenin、HH、Notch 和BMPs[38-40]。通過添加抗壞血酸、β-甘油磷酸酯、地塞米松、維生素D3、BMP-2、BMP-4、BMP-6 和BMP-7 刺激間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外實(shí)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，在此過程中，堿性磷酸酶L（ALPL）活性有所增強(qiáng)，鈣質(zhì)也將不斷沉積，細(xì)胞形成結(jié)節(jié)[41]。

2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞治療應(yīng)用研究

關(guān)于骨性關(guān)節(jié)炎等退行性疾病已有廣泛的研究基礎(chǔ)，但直接影響某基因以獲得治療卻不盡人意，目前的臨床手段僅能做到延緩疾病進(jìn)展但不能對其有所逆轉(zhuǎn)。自1994 年首次報(bào)道自體干細(xì)胞移植技術(shù)以來，研究人員對自體移植細(xì)胞治療關(guān)節(jié)損害進(jìn)行了大量研究，一般來說干細(xì)胞發(fā)揮治療作用是獲得足夠數(shù)量的干細(xì)胞，植入并加以誘導(dǎo)分化，達(dá)到組織的修復(fù)再生[42-43]。但隨著基礎(chǔ)研究的進(jìn)行，研究人員發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效益不僅歸因于它們的分化，還與它們分泌的因素有關(guān)[44]。

外泌體（exosome）形成于細(xì)胞內(nèi)涵體小室，屬于一類細(xì)胞外囊泡，富含蛋白、mRNA、miRNA 或IncRNA 等物質(zhì)，用于細(xì)胞間的信息傳遞。一些研究認(rèn)為，在軟骨組織中，間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體可減弱軟骨細(xì)胞凋亡、減緩基質(zhì)降解并減輕炎癥水平[45-47]；在骨折等損傷的愈合進(jìn)程中，也有研究證明了外泌體對于成骨分化具有促進(jìn)作用，可改善血管生成狀態(tài)并抑制骨質(zhì)丟失[48-49]。

3 影響骨骼發(fā)育的信號通路

骨骼的形成是一系列密切相關(guān)、緊密銜接的事件所構(gòu)成的生物學(xué)進(jìn)程。在骨骼發(fā)育的某些階段，轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)將引導(dǎo)祖細(xì)胞向各個(gè)方向分化，同時(shí)各個(gè)信號通路也協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，確保骨骼的適當(dāng)發(fā)育。

3.1 Hedgehog 信號通路

Hedgehog（HH）信號分子是一種蛋白質(zhì)配體，在一定范圍的組織內(nèi)擴(kuò)散，作用范圍很小。在哺乳動物中存在Sonic Hedgehog（SHH）、Indian Hedgehog（IHH）和Desert Hedgehog（DHH）3 個(gè)同源基因，目前對于SHH 的研究較另外兩個(gè)更為深入[50]。HH 的膜上受體由Patched homologue 1（PTCH1）和Smoothened homologue（SMO）共同構(gòu)成，在沒有HH 的情況下，PTCH 會抑制SMO，起負(fù)調(diào)控作用。當(dāng)HH 與PTCH結(jié)合時(shí)，PTCH 對SMO 的抑制作用被解除，下游基因被激活[51-52]。1980 年HH 的重要作用首次被明確，其決定了果蠅前后體節(jié)的發(fā)育差異[53]。在肢體發(fā)育的過程中，SHH 對于肢芽的前后形態(tài)起著重要控制作用[54]。除了SHH 本身外，神經(jīng)膠質(zhì)瘤關(guān)聯(lián)癌基因同源物2（GLI2）和神經(jīng)膠質(zhì)瘤關(guān)聯(lián)癌基因同源物3（GLI3）也是SHH 信號的轉(zhuǎn)錄因子靶點(diǎn)，是正常骨骼發(fā)育的必要條件[55-56]。HH 通路除了在發(fā)育過程中相當(dāng)重要外，在軟骨內(nèi)骨化過程中也有重要作用，HH 信號通過GLI1 或GLI2 調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化，并且GLI2又進(jìn)一步調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞主要調(diào)控因子RUNX2 的表達(dá)，在沒有HH 信號的情況下，成骨分化的進(jìn)程將會停止，導(dǎo)致軟骨內(nèi)骨化不完全和隨后的骨形成缺陷[57-60]。

3.2 Notch 信號通路

Notch 信號通路廣泛存在于各類動物，通過相鄰細(xì)胞之間的直接接觸調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織、器官的分化和發(fā)育。細(xì)胞膜上的Notch 受體有NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3 和NOTCH4 四種；Notch 配體則包括兩類家族5 種蛋白，分別是Jagged 家族（JAG1 和JAG2）和Delta 樣家族（DLL1、DLL3 和DLL4）。當(dāng)配體與受體發(fā)生相互作用時(shí)，細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)啟動，此過程會使γ 分泌酶復(fù)合體在presenilin 1（PS1）或presenilin 2（PS2）的幫助下被蛋白水解，進(jìn)而釋放出Notch 胞內(nèi)區(qū)Notch Intracellular Domain（NCID）[61]。一般情況下，CSL-DNA結(jié)合蛋白通過募集組蛋白脫乙酰酶（HDAC）等，對Notch 的下游靶基因起到抑制作用，當(dāng)Notch 信號激活時(shí)，NCID與CSL-DNA結(jié)合蛋白發(fā)生相互作用，解除其抑制作用，誘導(dǎo)HES 與HEY 等基因表達(dá)[62-63]。在Prrx1-Cre 小鼠中，在肢端敲除PS1、NOTCH1 和NOTCH2 將會導(dǎo)致生長板出肥大軟骨細(xì)胞比例上升，并抑制成骨的分化[62,64]。相關(guān)研究表明，NCID 不僅直接同RUNX2 發(fā)生作用，也通過調(diào)控（發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子）HES 和（YRPW 域相關(guān)發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子）HEY 對RUNX2 產(chǎn)生影響[61,65]。

3.3 Wnt/β catenin 信號通路

Wnt 蛋白是一個(gè)分泌型糖蛋白家族，是小鼠和人類成骨細(xì)胞分化和活動的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。經(jīng)典Wnt 信號傳導(dǎo)途徑是由β-catenin 介導(dǎo)的[66-67]。在沒有Wnt 刺激的情況下，細(xì)胞質(zhì)的β-catenin 被糖原合成酶-3β（GSK-3β）、腺瘤性息肉病大腸桿菌蛋白（APC）和Axin 的復(fù)合物磷酸化[68]。磷酸化的β-catenin 進(jìn)一步泛素化，并由蛋白體系統(tǒng)迅速降解，防止細(xì)胞質(zhì)的積累[69]。相反，Wnt 的刺激可抑制GSK-3β 的活性并誘導(dǎo)β-catenin 的細(xì)胞質(zhì)積累，積累的β-catenin 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，之后與T 細(xì)胞因子（TCF）/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子1（LEF1）和CREB 結(jié)合蛋白（CBP）復(fù)合物一起誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)[66,70]。Wnt 蛋白在確定細(xì)胞分化之前抑制成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[71-72]。對基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt10b 能促進(jìn)成骨，增加骨量[73]。體外研究發(fā)現(xiàn)，Wnt6、Wnt10a 和Wnt10b 抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化，并通過典型的Wnt 途徑促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化[73-74]。此外，成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分泌骨保護(hù)素（OPG），它是NF-κB 受體激活劑配體（RANKL）的誘餌受體，可抑制RANKL-RANK 的相互作用以抑制骨吸收，同時(shí)，上升的（破骨細(xì)胞形成抑制因子）OPG 表達(dá)將抑制破骨細(xì)胞的分化[75-78]。

3.4 骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMPs 信號通路

TGF-β 超家族包括TGF-β 亞家族、BMP 蛋白家族和激活素亞家族。TGF-β 復(fù)合物可通過與細(xì)胞表面的蛋白激酶受體相互作用，再經(jīng)SMAD 蛋白在胞內(nèi)進(jìn)一步傳導(dǎo)信號，最終目標(biāo)基因的表達(dá)發(fā)生變化，從而影響細(xì)胞的增值與分化過程[79]。經(jīng)證實(shí)，Bmp2通過靶向下游的Runx2 促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，Bmp2 基因敲除小鼠的骨量和骨小梁明顯減少。但是，單獨(dú)失去Bmp2 并不能使肢體成骨細(xì)胞的分化終止，而研究表明Bmp2 與Bmp4（或Bmp7）同時(shí)缺失時(shí)可導(dǎo)致成骨細(xì)胞異常分化，即Bmp2 與Bmp4（或Bmp7）必須協(xié)同表達(dá)[80]。同時(shí)，缺乏GDF5（BMP14）的小鼠和人類只在滑膜關(guān)節(jié)的一部分表現(xiàn)出關(guān)節(jié)形態(tài)發(fā)生缺陷，最明顯的是手腕和腳踝。但當(dāng)GDF5 活性過高時(shí)，這些關(guān)節(jié)也會出現(xiàn)異常[81]。

4 結(jié)語

間充質(zhì)干細(xì)胞在骨骼的發(fā)育中具有重要的作用。在正常的生理過程中，間充質(zhì)干細(xì)胞通過諸多復(fù)雜的通路機(jī)制完成持續(xù)增殖或準(zhǔn)確分化，某些調(diào)控因子的改變將帶給生物體不同程度的影響。對于骨骼發(fā)育進(jìn)程的調(diào)控研究已經(jīng)較為深入，這也將有效指導(dǎo)醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域的進(jìn)步。目前臨床研究的熱點(diǎn)是利用間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌功能在特定部位組織發(fā)揮作用，然而，這一方式在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用還處于初期，其發(fā)揮的具體影響機(jī)制尚未完全探明。此外，對于其藥動學(xué)及不良反應(yīng)也知之甚少，仍需在更多模式動物與臨床進(jìn)行更多深層次研究，相信由此帶來的臨床治療應(yīng)用也將不斷更新，并推動治療水平的進(jìn)步。