高通量測序技術在唐氏篩查臨界風險非高齡孕婦中的應用研究*

郭 剛 王麗芳 王康英

莆田學院附屬醫院，福建省莆田市 351100

我國是出生缺陷高發國家，數據顯示染色體異常作為重要的遺傳缺陷，可能會影響1/200～1/150的新生兒[1]。目前尚無治療染色體疾病的有效方法，因此作為二級預防的產前篩查和產前診斷顯得尤為關鍵。胎兒染色體非整倍體異常在出生缺陷兒中的發病率較高，準確篩查及診斷是臨床迫其需求的，目前臨床應用最為廣泛的是血清學篩查，但篩查準確性不可靠，漏診率高[2]，而介入性產前診斷，容易引起孕婦焦慮和恐懼，并有導致流產和宮內感染的風險[3]。無創產前基因檢測(NIPT)技術僅需采取孕婦靜脈血，利用高通量測序技術對母體外周血漿中的游離胎兒DNA片段進行測序，進行生物信息分析，從中得到胎兒染色體非整倍體信息[4-5]。NIPT已經成為一種新的篩查技術。本研究對2 464例血清學篩查臨界風險自愿進行NIPT的孕婦進行研究，結合介入性產前診斷的結果，分析NIPT對唐氏篩查臨界風險者的應用價值。

1 資料和方法

1.1 背景資料 選取2017—2019年間在我院血清學篩查臨界風險且進入無創DNA產前檢測的2 464例孕婦為研究對象。納入標準：(1)自愿NIPT；(2)1年內沒有異體輸血、細胞治療等；(3)夫妻雙方無明確染色體異常；(4)超聲單胎；(5)預產年齡<35周歲；(6)體重指數<40等。對選擇NIPT的孕婦應充分告訴該方法的適應證、局限性等，并簽署知情同意書，對結果高風險者建議做介入性產前診斷，對納入對象隨訪其妊娠結局及產后胎兒情況。

1.2 方法

1.2.1 中孕唐氏篩查：空腹狀態下抽取孕婦靜脈血2～3ml于空白管，離心盡快分離血清并及時檢測，未及時檢測的標本需低溫保存。中孕期唐氏篩查采用血清學三聯篩查即AFP+ Free-βhCG+uE3。儀器為芬蘭PerkinElmer公司提供的DELFLA 1 235型號，試劑為其配套試劑盒。根據檢測值再結合孕婦孕產年齡、孕周、體重等利用分析軟件給出該孕婦懷染色體非整倍體胎兒的風險率。唐氏篩查臨界風險截斷標準：21-三體為1/1 000～1/271；18-三體為1/1 000～1/351。

1.2.2 無創基因產前檢測(NIPT)：抽取孕婦外周血10ml于康健游離核酸保存采血管(CFDNA)后，立刻顛倒混勻，常溫8～30℃保存，并于當日送往福州博奧生物集團有限公司。測序儀器為基因測序儀BES4000，分析軟件為無創產前數據分析管理系統V3.0。通過高通量基因測序檢測孕婦外周血胎兒游離DNA并進行生物信息分析。NIPT正常范圍為-3.0

1.2.3 染色體核型分析：對NIPT異常結果經臨床醫生咨詢后自愿選擇介入性產前診斷的孕婦，在超聲的引導下經腹行羊膜腔穿刺，抽取25ml，送實驗室培養、收獲、固定、G顯帶等，計數2個獨立培養瓶的40個細胞，分析20個細胞，分辨率達320～400條帶水平。以人類細胞遺傳學命名的國際體制(ISCN)2016作為核型分析的標準。

1.3 后續追蹤和隨訪 對NIPT低風險的孕婦后續追蹤其彩超情況并隨訪其妊娠結局及新生兒情況，NIPT高風險孕婦建議進入產前診斷，關注其診斷結果并隨訪妊娠結局，對拒絕介入性產前診斷的應隨訪其妊娠結局及產后新生兒表現。

2 結果

本文通過研究2 464例唐氏篩查臨界風險自愿行NIPT的孕中期孕婦，結果為NIPT提示高風險24例，篩查陽性率為0.97%(24/2 464)。其中6例21-三體(T21)高風險，5例18-三體(T18)高風險，1例T18和T13共同高風險，7例性染色體異常，其他異常5例。對結果異常者的孕婦，電話通知至本院遺傳咨詢門診，經咨詢并同意選擇介入性產前診斷的孕婦19例，核型分析結果11例異常(其中確診4例21-三體，5例性染色體，其他核型異常2例)，核型正常8例。經分析NIPT的陽性預測值為57.89%(11/19)，具體見表1。

表1 24例NIPT高風險及核型分析結果

NIPT高風險拒絕介入性產前診斷的5例孕婦進行隨訪，其中3例18-三體高風險者因彩超提示多發畸形而選擇直接引產，其他2例隨訪孕婦自述胎兒無明顯形態異常。2 440例NIPT低風險隨訪至分娩后，其中59例隨訪不到，隨訪率97.58%，隨訪中發現3例流產，4例胎死宮內，7例不同程度彩超異常而引產，其余均未發現有明顯染色體異常新生兒。

3 討論

1997年，香港中文大學羅玉明教授首次證明孕婦外周血中有胎兒游離DNA，來源于胎盤，開辟了無創產前基因檢測(NIPT)的新方法。迄今為止，它已在世界許多國家得到廣泛應用[6]。無創產前基因檢測采用新一代高通量測序技術，基于母體血漿檢測游離胎兒DNA。經過生物信息學分析，檢測出胎兒染色體異常，國內外研究表明NIPT具有無創、安全、快速、準確性和可靠性高等特點[7-8]。NIPT篩查具有一定的臨床實用價值[9]。

目前臨床常用的產前診斷模式是血清學篩查高風險建議進入介入性產前診斷，這種模式還是會導致30%～40%的缺陷兒漏診[10]，為此有學者提出臨界風險的定義，研究報道有一定比例的漏篩出現在血清學篩查臨界風險的孕婦中[11]，因此對這部分人群的篩查很有必要的。且羊膜穿刺術有嚴格的適應證和禁忌證[12-13]這種方法可能會帶來胎兒宮內感染和羊水漏出的風險，同時增加孕婦的心理壓力，因此在孕婦中接受率不高。在一定程度上限制了臨床應用。因此，尋求一種合理實用的產前篩查診斷方法，實現胎兒染色體疾病的準確檢測，對于降低出生缺陷的發生率具有重要意義。

本文選取2017年1月—2019年12月在本院血清學篩查結果臨界風險經咨詢自愿選擇NIPT的單胎非高齡孕婦為研究對象，篩查出24例NIPT高風險孕婦，21-三體6例，18-三體5例，性染色體異常7例，T18和T13共同高風險1例，其他異常5例。咨詢建議行介入性產前診斷的19例，經核型及芯片結果確診符合的有11例，21-三體4例，18-三體0例，性染色體異常5例，其他異常2例。本文研究了2 464例孕婦，其中NIPT低風險的孕婦中59例沒有隨訪到。所以統計人數按2 405計。敏感性=真陽性病例數/(真陽性病例數+假陰性病例數)，特異性=真陰性病例數/(真陰性病例數+假陽性病例數)，陽性預測值=真陽性病例數/(真陽性病例數+假陽性病例數)，本研究中未出現假陰性病例。所以該方法對21-三體的敏感性為100%，特異性均為99.9%(2 403/2 405)，陽性預測值為66.67%(4/6)，性染色體的陽性預測值為71.43%(5/7)，而18-三體陽性預測值為0，可能因為數據不足和18-三體綜合征的胎兒往往表現多種臟器畸形，孕婦直接選擇引產。血清學臨界風險者相對高風險者基數較大，對其均行介入性產前診斷是不可取的，隨著技術的發展，2015年專家提出了NIPT可以應用于中風險人群的共識[14]。有研究表明，臨界風險的孕婦中生育唐氏兒的風險為0.46%[13]，本文確診4例21-三體，故唐氏兒的風險率為0.17%(4/2 405)的唐氏缺陷兒。目前國內外對NIPT應用于血清學篩查臨界風險的單胎非高齡的報道較少，本研究表明對于唐氏篩查臨界風險的單胎非高齡孕婦進行NIPT篩查是具有意義的，篩查陽性率為0.97%(24/2 464)。特殊病例討論：本研究出現1例NIPT提示T21/Chr4+/Chr8+異常的孕婦最終核型發現是正常的，后續隨訪發現孕婦本身患有白血病，因為惡性腫瘤干擾胎兒游離DNA的檢測，影響檢測結果[15]。

綜上所述，妊娠女性外周血胎兒游離DNA的高通量測序技術可用于臨界風險妊娠女性胎兒染色體疾病的產前篩查，具有較高的敏感性和特異性。可以作為產前診斷的重要補充，可以降低血清學臨界風險孕婦的穿刺率，降低出生缺陷的發生。但 NIPT 存在一定程度的假陽性，并且NIPT作為一種篩查技術，篩查異常者仍需結合傳統的羊水細胞核型分析，以提高對胎兒染色體疾病的診斷效能。